流式分選實驗技術(shù)服務(wù)|實驗技術(shù)服務(wù)

時間：2015/8/1閱讀：228

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測序?qū)嶒灹鞒蹋?br>1 作用原理：
對實體組織分散的作用原理主要有3方面：① 可以破壞組織間的膠原纖維,、彈性纖維等；②可以水解組織間的粘多糖等物質(zhì),；③可以水解組織細(xì)胞間的緊密聯(lián)結(jié)裝置的蛋白質(zhì)物質(zhì),。酶消化法是實體瘤、培養(yǎng)細(xì)胞分散為單細(xì)胞的主要方法之一,。常用的酶類試劑有：蛋白酶類——胃蛋白酶,、木瓜蛋白酶、鏈酶蛋白酶和中性蛋白酶等,，都能解離組織中的細(xì)胞,。胰蛋白酶能水解脂鍵和肽鍵；膠原酶能降解幾種分子類型的膠原,；溶菌酶能水解糖蛋白和肽的糖苷鍵,；彈性蛋白酶能消化連接組織的糖蛋白和彈性蛋白的纖維,。不同酶對細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間不同組分有特異作用，可根據(jù)分散組織類型來確定使用的酶類,。
2 注意事項：
① 酶需要溶解于適當(dāng)?shù)娜芤褐?，而這些溶液不致于造成酶效價降低；②要注意酶的使用濃度和消化時間,；③要注意酶活性的PH值,。如胃蛋白酶在堿性環(huán)境中失去活性，胰蛋白酶在中性溶劑中活性不佳等,；④ 要隨時注意影響酶活性的其它因素,，如酶的生產(chǎn)批號等。
實驗方法
① 將組織切成薄片,，置入試管中,；
② 首先加入EDTA液5ml，室溫下0.5h,，離心棄之,；
③ 再加入胰酶-EDTA液5ml。在37℃恒溫水浴振蕩器內(nèi)30min,；
④ 用300目尼龍網(wǎng)過濾,，離心沉淀1000prm，5min,。再以生理鹽水洗2-3次,；
⑤ 細(xì)胞固定或低溫保存?zhèn)溆谩?br>血小板標(biāo)記方法
全血法單標(biāo)測血小板CD62p、CD63,、CD42b,、CD41、CD61等指標(biāo),。
染色方法步驟：
（1）采血枸櫞酸鹽或EDTA抗凝,；
（2） 10μl熒光標(biāo)記抗體，加100μl PBS,，再加5μl全血（樣品管）,；
10μl抗體同型對照，加100μl PBS,，再加5μl全血（對照管）,；
輕輕混勻，室溫孵育15min,；
（3）加2-3ml PBS（1% PFA）終止反應(yīng),，上機檢測分析。
機械法分散實體組織包括：用手術(shù)剪刀剪碎或者用鋒利的解剖刀剁碎組織，用勻漿器勻漿,，再用細(xì)注射針頭抽吸細(xì)胞或用300目尼龍網(wǎng)濾出單細(xì)胞懸液,；采用搓網(wǎng)法也能獲得大量細(xì)胞。機械法易造成細(xì)胞碎片和細(xì)胞團塊,，所以機械法常與其它方法配合使用。
1 剪碎法：
① 將組織塊放入平皿中,，加入少量生理鹽水,；
② 用剪刀將組織剪至勻漿狀；
③ 加入10ml生理鹽水,；
④ 用吸管吸取組織勻漿,，先以100目尼龍網(wǎng)過濾到試管中；
⑤ 離心沉淀1000prm,3-5min,，再用生理鹽水洗3遍,，每次以低速（500-800prm）短時離心沉淀去除細(xì)胞碎片；
⑥ 以300目尼龍網(wǎng)濾去細(xì)胞團塊,；
⑦ 細(xì)胞用固定液固定或低溫保存?zhèn)溆谩?br>2 網(wǎng)搓法
① 將100目,，300目尼龍網(wǎng)扎在小燒杯上；
② 把剪碎的的組織放在網(wǎng)上,，以眼科鑷子輕輕搓組織塊,，邊搓邊加生理鹽水沖洗，直到將組織搓完,；
③ 收集細(xì)胞懸液,，離心沉淀500-800prm，2分鐘,；
④ 固定細(xì)胞或低溫保存?zhèn)溆谩?br>3 研磨法
準(zhǔn)備一只70ml研磨器,。
① 先將組織剪成1-2mm3大小組織塊；
② 放入組織研磨器中加入1-2ml生理鹽水,；
③ 轉(zhuǎn)動研棒,，研至勻漿；
④ 加入10ml生理鹽水,，沖洗研磨器,；
⑤ 收集細(xì)胞懸液，并經(jīng)300目尼龍網(wǎng)過濾,，離心沉淀500-800 prm,，1-2 min，再以生理鹽水洗3 遍,，離心沉淀,；
⑥ 固定或低溫保存細(xì)胞懸液，備用,。

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