關(guān)鍵詞:基因甲基化檢測(cè)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)
簡(jiǎn)介：世界*品牌基因甲基化檢測(cè)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)原裝,，質(zhì)量保證,*。
基因甲基化檢測(cè)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系,。
我們具備豐富的蛋白表達(dá)設(shè)計(jì)經(jīng)驗(yàn)及實(shí)驗(yàn)操作技巧,，承諾客戶不成功不收費(fèi)。我們所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)真實(shí)可信,，我們提供原始的表達(dá)菌株和克隆質(zhì)粒,，客戶可以依據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)報(bào)告重復(fù)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
產(chǎn)品品牌： http://www.,。,。ｃｏｍ/goodsid/fenleiyi/2868603/1.html
測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程：
DNA甲基化是zui早發(fā)現(xiàn)的基因表觀修飾方式之一，真核生物中的甲基化僅發(fā)生于胞嘧啶,，即在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)的作用下使CpG二核苷酸5'-端的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?'-甲基胞嘧啶,。DNA甲基化通常抑制基因表達(dá)，去甲基化則誘導(dǎo)了基因的重新活化和表達(dá),。這種DNA修飾方式在不改變基因序列前提下實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控,。
檢測(cè)程序
1.甲基化特異性的PCR(Methylation-specific PCR，MSP)
用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA,，所有未發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶,，而甲基化的胞嘧啶不變;隨后設(shè)計(jì)針對(duì)甲基化和非甲基化序列的引物進(jìn)行PCR。通過(guò)電泳檢測(cè)MSP擴(kuò)增產(chǎn)物,，如果用針對(duì)處理后甲基化DNA鏈的引物能得到擴(kuò)增片段,，則說(shuō)明該位點(diǎn)存在甲基化;反之，說(shuō)明被檢測(cè)的位點(diǎn)不存在甲基化,。
2.亞硫酸氫鹽測(cè)序法(Bisulfite sequencing PCR,，BSP)
用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，則未發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶,，而甲基化的胞嘧啶不變,。隨后設(shè)計(jì)BSP引物進(jìn)行PCR，在擴(kuò)增過(guò)程中尿嘧啶全部轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶,，zui后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序就可以判斷CpG位點(diǎn)是否發(fā)生甲基化稱為BSP-直接測(cè)序方法,。將PCR產(chǎn)物克隆至載體后進(jìn)行測(cè)序，可以提高測(cè)序成功率，這種方法稱為BSP-克隆測(cè)序法,。
3.高分辨率熔解曲線法(High Resolution Melting,，HRM)
在非CpG島位置設(shè)計(jì)一對(duì)針對(duì)亞硫酸氫鹽修飾后的DNA雙鏈的引物，這對(duì)引物中間的片段包含感興趣的CpG島,。若這些CpG島發(fā)生了甲基化,，用亞硫酸氫鹽處理后,，未甲基化的胞嘧啶經(jīng)PCR擴(kuò)增后轉(zhuǎn)變成胸腺嘧啶,，而甲基化的胞嘧啶不變，樣品中的GC含量發(fā)生改變,，從而導(dǎo)致熔解溫度的變化.
送樣要求
細(xì)胞(≥106 個(gè)),、組織(≥300mg)、血液(≥1ml),、血清(≥1.5ml)等樣品材料,，基因組DNA(體積≥20μl，濃度≥50 ng/μl),。
DNA甲基化的位點(diǎn)與程度的實(shí)驗(yàn)方法有三類：
（1）（M SREs）利用對(duì)甲基化堿基敏感的限制性內(nèi)切酶,。該酶不能切割甲基化的堿基位點(diǎn)，從而產(chǎn)生片段差異,，電泳后,，根據(jù)片段與量的差異找到甲基化位點(diǎn)與甲基化程度，
（2）另一類是利用將沒(méi)有甲基化的C變?yōu)槠渌鼔A基或其它物質(zhì),，而甲基化的C不會(huì)發(fā)生相應(yīng)變化來(lái)識(shí)別甲基化位點(diǎn),。甲基化特異的PCR (M ethylation-specific PCR,MSP)是較常用的方法。
（3）一種通過(guò)合成方法進(jìn)行序列分析的方法,，它通過(guò)核苷酸和模板結(jié)合后釋放的焦磷酸引發(fā)酶級(jí)聯(lián)反應(yīng),，促使熒光素發(fā)光并進(jìn)行檢測(cè)，Pyrosequencing技術(shù)是近年一種全新的技術(shù),，這項(xiàng)技術(shù)曾經(jīng)被用作單核苷酸多態(tài)性（SNP）的基因型和單倍型的檢測(cè),，以及細(xì)菌和病毒的鑒定和分型研究。這項(xiàng)技術(shù)的一個(gè)主要特點(diǎn)是在Pyrogarm?軟件上顯示的峰值高度來(lái)自于序列分析的原始數(shù)據(jù),，通過(guò)峰值的高度可以的檢測(cè)混合DNA模板中等位基因的頻率,，這種方法同樣可以用于石蠟包埋的組織，并且具有較高的重復(fù)性和性,。
MSP 實(shí)驗(yàn)流程：
1. 基因組抽提,；
2. 基因組DNA定量；
3. 重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化（C轉(zhuǎn)化為U),，本步實(shí)驗(yàn)至關(guān)重要,，轉(zhuǎn)化效率高低直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，所以,，需要實(shí)驗(yàn)者在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不斷摸索合適的實(shí)驗(yàn)條件以確保較高的轉(zhuǎn)化效率,；
4. 引物設(shè)計(jì)（每個(gè)基因設(shè)計(jì)兩對(duì)引物,，分別為：甲基化引物M，非基因化引物U,，對(duì)應(yīng)擴(kuò)增甲基化和非甲基化的目的片段）,，有時(shí)需設(shè)計(jì)巢式引物；
5. PCR 擴(kuò)增：對(duì)甲基化和非甲基化的目的片段分別擴(kuò)增,此時(shí)盡可能使用梯度PCR儀,，可以同時(shí)使用不同的退火溫度,，以篩選合適的退火溫度；
6. PCR 產(chǎn)物電泳,；
7. 電泳結(jié)果分析（定性即有無(wú)甲基化,，半定量即甲基化程度高低）。
