關(guān)鍵詞:基因甲基化檢測技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)
簡介：世界*品牌基因甲基化檢測技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)原裝,，質(zhì)量保證,*。
基因甲基化檢測技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系,。
我們具備豐富的蛋白表達(dá)設(shè)計(jì)經(jīng)驗(yàn)及實(shí)驗(yàn)操作技巧，承諾客戶不成功不收費(fèi),。我們所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)真實(shí)可信,，我們提供原始的表達(dá)菌株和克隆質(zhì)粒，客戶可以依據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)報(bào)告重復(fù)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,。
產(chǎn)品品牌：   http://www.,。。ｃｏｍ/goodsid/fenleiyi/2868603/1.html    
測序?qū)嶒?yàn)流程：
DNA甲基化是zui早發(fā)現(xiàn)的基因表觀修飾方式之一,，真核生物中的甲基化僅發(fā)生于胞嘧啶,，即在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)的作用下使CpG二核苷酸5'-端的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?'-甲基胞嘧啶。DNA甲基化通常抑制基因表達(dá),，去甲基化則誘導(dǎo)了基因的重新活化和表達(dá),。這種DNA修飾方式在不改變基因序列前提下實(shí)現(xiàn)對基因表達(dá)的調(diào)控。
檢測程序
1.甲基化特異性的PCR(Methylation-specific PCR,，MSP)
用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA,，所有未發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變;隨后設(shè)計(jì)針對甲基化和非甲基化序列的引物進(jìn)行PCR,。通過電泳檢測MSP擴(kuò)增產(chǎn)物,，如果用針對處理后甲基化DNA鏈的引物能得到擴(kuò)增片段，則說明該位點(diǎn)存在甲基化;反之，說明被檢測的位點(diǎn)不存在甲基化,。
2.亞硫酸氫鹽測序法(Bisulfite sequencing PCR,，BSP)
用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，則未發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶,，而甲基化的胞嘧啶不變,。隨后設(shè)計(jì)BSP引物進(jìn)行PCR，在擴(kuò)增過程中尿嘧啶全部轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶,，zui后對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序就可以判斷CpG位點(diǎn)是否發(fā)生甲基化稱為BSP-直接測序方法,。將PCR產(chǎn)物克隆至載體后進(jìn)行測序，可以提高測序成功率,，這種方法稱為BSP-克隆測序法,。
3.高分辨率熔解曲線法(High Resolution Melting，HRM)
在非CpG島位置設(shè)計(jì)一對針對亞硫酸氫鹽修飾后的DNA雙鏈的引物,，這對引物中間的片段包含感興趣的CpG島,。若這些CpG島發(fā)生了甲基化，用亞硫酸氫鹽處理后,，未甲基化的胞嘧啶經(jīng)PCR擴(kuò)增后轉(zhuǎn)變成胸腺嘧啶,，而甲基化的胞嘧啶不變，樣品中的GC含量發(fā)生改變,，從而導(dǎo)致熔解溫度的變化.
送樣要求
細(xì)胞(≥106 個(gè))、組織(≥300mg),、血液(≥1ml),、血清(≥1.5ml)等樣品材料，基因組DNA(體積≥20μl,，濃度≥50 ng/μl),。
DNA甲基化的位點(diǎn)與程度的實(shí)驗(yàn)方法有三類：
（1）（M SREs）利用對甲基化堿基敏感的限制性內(nèi)切酶。該酶不能切割甲基化的堿基位點(diǎn),，從而產(chǎn)生片段差異,，電泳后，根據(jù)片段與量的差異找到甲基化位點(diǎn)與甲基化程度,，
（2）另一類是利用將沒有甲基化的C變?yōu)槠渌鼔A基或其它物質(zhì),，而甲基化的C不會(huì)發(fā)生相應(yīng)變化來識(shí)別甲基化位點(diǎn)。甲基化特異的PCR (M ethylation-specific PCR,MSP)是較常用的方法,。
（3）一種通過合成方法進(jìn)行序列分析的方法,，它通過核苷酸和模板結(jié)合后釋放的焦磷酸引發(fā)酶級聯(lián)反應(yīng)，促使熒光素發(fā)光并進(jìn)行檢測,，Pyrosequencing技術(shù)是近年一種全新的技術(shù),，這項(xiàng)技術(shù)曾經(jīng)被用作單核苷酸多態(tài)性（SNP）的基因型和單倍型的檢測，以及細(xì)菌和病毒的鑒定和分型研究,。這項(xiàng)技術(shù)的一個(gè)主要特點(diǎn)是在Pyrogarm?軟件上顯示的峰值高度來自于序列分析的原始數(shù)據(jù),，通過峰值的高度可以的檢測混合DNA模板中等位基因的頻率,，這種方法同樣可以用于石蠟包埋的組織，并且具有較高的重復(fù)性和性,。
 MSP 實(shí)驗(yàn)流程：  
1.       基因組抽提,；
2.       基因組DNA定量；
3.       重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化（C轉(zhuǎn)化為U),，本步實(shí)驗(yàn)至關(guān)重要,，轉(zhuǎn)化效率高低直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，所以,，需要實(shí)驗(yàn)者在實(shí)驗(yàn)過程中不斷摸索合適的實(shí)驗(yàn)條件以確保較高的轉(zhuǎn)化效率,；
4.       引物設(shè)計(jì)（每個(gè)基因設(shè)計(jì)兩對引物，分別為：甲基化引物M,，非基因化引物U,，對應(yīng)擴(kuò)增甲基化和非甲基化的目的片段），有時(shí)需設(shè)計(jì)巢式引物,；
5.       PCR 擴(kuò)增：對甲基化和非甲基化的目的片段分別擴(kuò)增,此時(shí)盡可能使用梯度PCR儀,，可以同時(shí)使用不同的退火溫度，以篩選合適的退火溫度,；
6.       PCR 產(chǎn)物電泳,；
7.       電泳結(jié)果分析（定性即有無甲基化，半定量即甲基化程度高低）,。
BSP （亞硫酸鹽測序法）實(shí)驗(yàn)流程：  
1.       基因組抽提,；
2.       基因組DNA定量；
3.       重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化（C轉(zhuǎn)化為U),，本步實(shí)驗(yàn)至關(guān)重要,，轉(zhuǎn)化效率高低直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，所以,，需要實(shí)驗(yàn)者在實(shí)驗(yàn)過程中不斷摸索合適的實(shí)驗(yàn)條件以確保較高的轉(zhuǎn)化效率,；
4.       引物設(shè)計(jì)（每個(gè)基因設(shè)計(jì)一對引物，引物位置盡可能的避開DNA中的CG位點(diǎn)）,，有時(shí)需設(shè)計(jì)巢式引物,；
5.       PCR 擴(kuò)增：對實(shí)驗(yàn)樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，此時(shí)盡可能使用梯度PCR儀,，可以同時(shí)使用不同的退火溫度,，以篩選合適的退火溫度。
6.       PCR 產(chǎn)物電泳,；
7.       對目的條帶進(jìn)行切膠回收,；
8.       回收后的PCR產(chǎn)物連接克隆載體（T載體）；
9.       轉(zhuǎn)化E.coli H5α；
10.      挑選陽性克隆測序,；
11.      測序結(jié)果分析：實(shí)驗(yàn)專業(yè)甲基化分析軟件對測序序列進(jìn)行甲基化分析,，可以得到如下數(shù)據(jù)：
     A. 測序序列與目的序列的相似度（%）；
     B. C-T 轉(zhuǎn)化效率（%）,；
     C. 目的片段中每個(gè)CG的甲基化情況（點(diǎn)狀圖）,；
     D. 每個(gè)CG的甲基化率(%)；