關(guān)鍵詞:IP和Co-IP|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)
簡介：世界*品牌IP和Co-IP|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)原裝，質(zhì)量保證,*,。
IP和Co-IP|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系。
我們具備豐富的蛋白表達(dá)設(shè)計(jì)經(jīng)驗(yàn)及實(shí)驗(yàn)操作技巧,，承諾客戶不成功不收費(fèi),。在獲得重組蛋白產(chǎn)品的同時(shí)，我們也會(huì)提供相應(yīng)的原始數(shù)據(jù)和原始圖片,不需要再額外花費(fèi)精力重復(fù)實(shí)驗(yàn),。另一方面,，我們所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)真實(shí)可信，我們提供原始的表達(dá)菌株和克隆質(zhì)粒,，客戶可以依據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)報(bào)告重復(fù)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,。
產(chǎn)品品牌：   http://www.,。。ｃｏｍ/goodsid/fenleiyi/2868603/1.html    
測序?qū)嶒?yàn)流程：
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）可以：（1）測定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合,；（2）確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔,；（3）分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物。
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法,。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法,。
其原理是：當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來,。如果用蛋白質(zhì)X的抗體免疫沉淀X,，那么與X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來。目前多用精制的proreinA預(yù)先結(jié)合固化在argarose的beads上,，使之與含有抗原的溶液及抗體反應(yīng)后,，beads上的proreinA就能吸附抗原達(dá)到精制的目的。這種方法常用于測定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合,；也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔,。
實(shí)驗(yàn)材料    蛋白質(zhì)、試劑,、試劑盒    RIPA BufferPBSProtein A agarose瓊脂糖考馬斯亮藍(lán)染色液
儀器,、耗材    離心機(jī)搖床EP管細(xì)胞刮子離心管培養(yǎng)板電泳儀電泳槽液相色譜儀
試劑準(zhǔn)備 
1.  預(yù)冷PBS，RIPA Buffer,，細(xì)胞刮子（用保鮮膜包好后,，埋冰下），離心機(jī),。
2.  用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次,，zui后一次吸干PBS。
3.  加入預(yù)冷的RIPA Buffer(1 ml/107個(gè)細(xì)胞,、10 cm培養(yǎng)皿或150 cm2培養(yǎng)瓶,，0.5 ml/5×106個(gè)細(xì)胞、6 cm培養(yǎng)皿,、75 cm2培養(yǎng)瓶）,。
4.  用預(yù)冷的細(xì)胞刮子將細(xì)胞從培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶上刮下，把懸液轉(zhuǎn)到1.5EP管中,，4℃,，緩慢晃動(dòng)15 min（EP管插冰上，置水平搖床上）,。
5.  4℃,，14000 g離心15 min，立即將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中,。
6.  準(zhǔn)備Protein A agarose,，用PBS 洗兩遍珠子,，然后用PBS配制成50%濃度，建議減掉槍尖部分,，避免在涉及瓊脂糖珠的操作中破壞瓊脂糖珠,。
7.   每1 ml總蛋白中加入100 μl Protein A瓊脂糖珠（50%），4℃搖晃10 min（EP管插冰上,，置水平搖床上）,，以去除非特異性雜蛋白，降低背景,。
8.   4℃,，14000 g離心1 5min，將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中,，去除Protein A珠子,。
9． （Bradford 法）做蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定蛋白濃度,，測前將總蛋白至少稀釋1：10倍以上，以減少細(xì)胞裂解液中去垢劑的影響（定量,，分裝后,，可以在-20℃保存一個(gè)月）。
10.  用PBS將總蛋白稀釋到約1 μg/μl,，以降低裂解液中去垢劑的濃度,，如果興趣蛋白在細(xì)胞中含量較低，則總蛋白濃度應(yīng)該稍高（如10 μg/μl）,。
11.  加入一定體積的兔抗到500 μl總蛋白中,，抗體的稀釋比例因興趣蛋白在不同細(xì)胞系中的多少而異。
12.  4℃緩慢搖動(dòng)抗原抗體混合物室溫2h,，激酶或磷酸酯酶活性分析建議用2 h室溫孵育,。
13.  加入100 μl Protein A瓊脂糖珠來捕捉抗原抗體復(fù)合物，4℃緩慢搖動(dòng)抗原抗體混合物室溫1 h,，如果所用抗體為鼠抗或雞抗,，建議加2 μl"過渡抗體"（兔抗鼠IgG，兔抗雞IgG）,。
14.  14000 rpm瞬時(shí)離心5 s,，收集瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物，去上清,，用預(yù)冷的RIPA buffer洗3遍,，800 μl/遍，RIPA buffer有時(shí)候會(huì)破壞瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物內(nèi)部的結(jié)合,，可以使用PBS,。
15.  用60 μl 2×上樣緩沖液將瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物懸起,，輕輕混勻，緩沖液的量依據(jù)上樣多少的需要而定（60 μl足夠上三道）,。
16.  將上樣樣品煮5 min,，以游離抗原，抗體,，珠子,，離心，將上清電泳,，收集剩余瓊脂糖珠,，上清也可以暫時(shí)凍-20℃，留待以后電泳,，電泳前應(yīng)再次煮5 min變性,。
免疫共沉淀反應(yīng) 
1． 轉(zhuǎn)染后24-48 h 可收獲細(xì)胞，加入適量細(xì)胞裂解緩沖液（含蛋白酶抑制劑）,，冰上裂解30 min,細(xì)胞裂解液于4°C,，zui大轉(zhuǎn)速離心30 min后取上清；
2． 取少量裂解液以備Western blot分析,，剩余裂解液加1μg相應(yīng)的抗體加入到細(xì)胞裂解液,，4°C緩慢搖晃孵育；
3． 取10 μl protein A 瓊脂糖珠,，用適量裂解緩沖液洗3 次,，每次3 000 rpm離心3 min；
4. 將預(yù)處理過的10μl protein A 瓊脂糖珠加入到和抗體孵育的細(xì)胞裂解液中4°C緩慢搖晃孵育2-4 h,，使抗體與protein A瓊脂糖珠偶連,；
5． 免疫沉淀反應(yīng)后，在4°C 以3,000 rpm 速度離心3 min,，將瓊脂糖珠離心至管底,；將上清小心吸去，瓊脂糖珠用1 ml裂解緩沖液洗3－4次,；zui后加入15 μl的2×SDS 上樣緩沖液,，沸水煮5分鐘；
6． SDS-PAGE,，Western blotting或質(zhì)譜儀分析,。
通過免疫共沉淀確定結(jié)合蛋白 
1．用磷酸鹽緩沖液洗30塊10 cm培養(yǎng)板上的適宜細(xì)胞。刮去每塊板上的細(xì)胞到1 ml冰冷的EBC裂解緩沖液中,；
2．將每毫升細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到微量離心管中,，在微量離心機(jī)上4℃以zui大速度離心15 ；
3．收集上清（約30 ml）并加入30 μg的適當(dāng)抗體，4℃搖動(dòng)免疫沉淀物1 h,；
4．加入0.9 ml的蛋白質(zhì)A-Sepharose 懸液,，4℃搖動(dòng)免疫沉淀物30 min；
5．用含900 mmol/L NaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物,，再重復(fù)洗5次,。zui后，用NETN洗一次,；
6．吸出混合物的液體部分,。加入800 μl的1×SDS膠加樣緩沖液到球珠中，煮沸4 min
7．將樣品加入到大孔的不連續(xù)SDS-PAGE梯度膠中,，在10 mA的恒定電流下電泳,；
8．通過考馬斯亮藍(lán)染色觀察蛋白質(zhì)泳帶；
9．從膠上切下目標(biāo)帶,，將其放到微量離心管中,，用1 ml 50%乙腈洗兩次，每次3 min,；
10． 用胰蛋白酶消化膠中的蛋白質(zhì),，再將肽電洗脫；
11． 通過窄孔液相色譜分離肽,。將收集的肽在ABI 477A或494A機(jī)器上進(jìn)行自動(dòng)Edman降解測序,。