關(guān)鍵詞:IP和Co-IP|實驗技術(shù)服務
簡介：世界*品牌IP和Co-IP|實驗技術(shù)服務原裝,，質(zhì)量保證,*,。
IP和Co-IP|實驗技術(shù)服務——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達體系,。
我們具備豐富的蛋白表達設計經(jīng)驗及實驗操作技巧，承諾客戶不成功不收費,。在獲得重組蛋白產(chǎn)品的同時，我們也會提供相應的原始數(shù)據(jù)和原始圖片,不需要再額外花費精力重復實驗,。另一方面,，我們所有的實驗數(shù)據(jù)真實可信，我們提供原始的表達菌株和克隆質(zhì)粒,，客戶可以依據(jù)我們的實驗報告重復我們的實驗結(jié)果,。
產(chǎn)品品牌：   http://www.。,。ｃｏｍ/goodsid/fenleiyi/2868603/1.html    
測序?qū)嶒灹鞒蹋?br>免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）可以：（1）測定兩種目標蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合,；（2）確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔；（3）分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復合物,。
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法,。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。
其原理是：當細胞在非變性條件下被裂解時,，完整細胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來,。如果用蛋白質(zhì)X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來,。目前多用精制的proreinA預先結(jié)合固化在argarose的beads上,，使之與含有抗原的溶液及抗體反應后，beads上的proreinA就能吸附抗原達到精制的目的,。這種方法常用于測定兩種目標蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合,；也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔。
實驗材料    蛋白質(zhì),、試劑,、試劑盒    RIPA BufferPBSProtein A agarose瓊脂糖考馬斯亮藍染色液
儀器、耗材    離心機搖床EP管細胞刮子離心管培養(yǎng)板電泳儀電泳槽液相色譜儀
試劑準備 
1.  預冷PBS,，RIPA Buffer,，細胞刮子（用保鮮膜包好后，埋冰下）,，離心機,。
2.  用預冷的PBS洗滌細胞兩次，zui后一次吸干PBS。
3.  加入預冷的RIPA Buffer(1 ml/107個細胞,、10 cm培養(yǎng)皿或150 cm2培養(yǎng)瓶,，0.5 ml/5×106個細胞、6 cm培養(yǎng)皿,、75 cm2培養(yǎng)瓶）,。
4.  用預冷的細胞刮子將細胞從培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶上刮下，把懸液轉(zhuǎn)到1.5EP管中,，4℃,，緩慢晃動15 min（EP管插冰上，置水平搖床上）,。
5.  4℃,，14000 g離心15 min，立即將上清轉(zhuǎn)移到一個新的離心管中,。
6.  準備Protein A agarose,，用PBS 洗兩遍珠子，然后用PBS配制成50%濃度,，建議減掉槍尖部分,，避免在涉及瓊脂糖珠的操作中破壞瓊脂糖珠。
7.   每1 ml總蛋白中加入100 μl Protein A瓊脂糖珠（50%）,，4℃搖晃10 min（EP管插冰上,，置水平搖床上），以去除非特異性雜蛋白,，降低背景,。
8.   4℃，14000 g離心1 5min,，將上清轉(zhuǎn)移到一個新的離心管中,，去除Protein A珠子。
9． （Bradford 法）做蛋白標準曲線,，測定蛋白濃度,，測前將總蛋白至少稀釋1：10倍以上，以減少細胞裂解液中去垢劑的影響（定量,，分裝后，可以在-20℃保存一個月）,。
10.  用PBS將總蛋白稀釋到約1 μg/μl,，以降低裂解液中去垢劑的濃度，如果興趣蛋白在細胞中含量較低,，則總蛋白濃度應該稍高（如10 μg/μl）,。
11.  加入一定體積的兔抗到500 μl總蛋白中，抗體的稀釋比例因興趣蛋白在不同細胞系中的多少而異。
12.  4℃緩慢搖動抗原抗體混合物室溫2h,，激酶或磷酸酯酶活性分析建議用2 h室溫孵育,。
13.  加入100 μl Protein A瓊脂糖珠來捕捉抗原抗體復合物，4℃緩慢搖動抗原抗體混合物室溫1 h,，如果所用抗體為鼠抗或雞抗,，建議加2 μl"過渡抗體"（兔抗鼠IgG，兔抗雞IgG）,。
14.  14000 rpm瞬時離心5 s,，收集瓊脂糖珠-抗原抗體復合物，去上清,，用預冷的RIPA buffer洗3遍,，800 μl/遍，RIPA buffer有時候會破壞瓊脂糖珠-抗原抗體復合物內(nèi)部的結(jié)合,，可以使用PBS,。
15.  用60 μl 2×上樣緩沖液將瓊脂糖珠-抗原抗體復合物懸起，輕輕混勻,，緩沖液的量依據(jù)上樣多少的需要而定（60 μl足夠上三道）,。
16.  將上樣樣品煮5 min，以游離抗原,，抗體,，珠子，離心,，將上清電泳,，收集剩余瓊脂糖珠，上清也可以暫時凍-20℃,，留待以后電泳,，電泳前應再次煮5 min變性。
免疫共沉淀反應 
1． 轉(zhuǎn)染后24-48 h 可收獲細胞,，加入適量細胞裂解緩沖液（含蛋白酶抑制劑）,，冰上裂解30 min,細胞裂解液于4°C，zui大轉(zhuǎn)速離心30 min后取上清,；
2． 取少量裂解液以備Western blot分析,，剩余裂解液加1μg相應的抗體加入到細胞裂解液，4°C緩慢搖晃孵育,；
3． 取10 μl protein A 瓊脂糖珠,，用適量裂解緩沖液洗3 次，每次3 000 rpm離心3 min,；
4. 將預處理過的10μl protein A 瓊脂糖珠加入到和抗體孵育的細胞裂解液中4°C緩慢搖晃孵育2-4 h,，使抗體與protein A瓊脂糖珠偶連；
5． 免疫沉淀反應后，在4°C 以3,000 rpm 速度離心3 min,，將瓊脂糖珠離心至管底,；將上清小心吸去，瓊脂糖珠用1 ml裂解緩沖液洗3－4次,；zui后加入15 μl的2×SDS 上樣緩沖液,，沸水煮5分鐘；
6． SDS-PAGE,，Western blotting或質(zhì)譜儀分析,。
通過免疫共沉淀確定結(jié)合蛋白 
1．用磷酸鹽緩沖液洗30塊10 cm培養(yǎng)板上的適宜細胞。刮去每塊板上的細胞到1 ml冰冷的EBC裂解緩沖液中,；
2．將每毫升細胞懸液轉(zhuǎn)移到微量離心管中,，在微量離心機上4℃以zui大速度離心15 ；
3．收集上清（約30 ml）并加入30 μg的適當抗體,，4℃搖動免疫沉淀物1 h,；
4．加入0.9 ml的蛋白質(zhì)A-Sepharose 懸液，4℃搖動免疫沉淀物30 min,；
5．用含900 mmol/L NaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物,，再重復洗5次。zui后,，用NETN洗一次,；
6．吸出混合物的液體部分。加入800 μl的1×SDS膠加樣緩沖液到球珠中,，煮沸4 min
7．將樣品加入到大孔的不連續(xù)SDS-PAGE梯度膠中,，在10 mA的恒定電流下電泳；
8．通過考馬斯亮藍染色觀察蛋白質(zhì)泳帶,；
9．從膠上切下目標帶,，將其放到微量離心管中，用1 ml 50%乙腈洗兩次,，每次3 min,；
10． 用胰蛋白酶消化膠中的蛋白質(zhì)，再將肽電洗脫,；
11． 通過窄孔液相色譜分離肽,。將收集的肽在ABI 477A或494A機器上進行自動Edman降解測序。