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454(GS FLX系統(tǒng))超高通量測序|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)

時間:2015/6/2閱讀:660
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關(guān)鍵詞:454(GS FLX系統(tǒng))超高通量測序|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)
簡介:世界*品牌454(GS FLX系統(tǒng))超高通量測序|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)原裝,,質(zhì)量保證,*。
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實(shí)驗(yàn)描述               
GS FLX系統(tǒng)的工作流程
GS FLX系統(tǒng)的流程概括起來,,就是“一個片段 = 一個磁珠 = 一條讀長(One fragment = One bead = One read)",。
1)樣品輸入并片段化:GS FLX系統(tǒng)支持各種不同來源的樣品,包括基因組DNA,、PCR產(chǎn)物,、BAC,、cDNA、小分子RNA等等,。大的樣品例如基因組DNA或者BAC等被打斷成300-800 bp的片段,;對于小分子的非編碼RNA或者PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,這一步則不需要,。
2)文庫制備:借助一系列標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù),,將A和B接頭(3’和5’端具有特異性)連接到DNA段上。接頭也將用于后續(xù)的純化,,擴(kuò)增和測序步驟,。變性處理回收單鏈的DNA(sstDNA),具有A,、B接頭的單鏈DNA段組成了樣品文庫,。
3)一個DNA段=一個磁珠:單鏈DNA文庫被固定在特別設(shè)計(jì)的DNA捕獲磁珠上。每一個磁珠攜帶了一個*的單鏈DNA段,。磁珠結(jié)合的文庫被擴(kuò)增試劑乳化,,形成油包水的混合物,這樣就形成了只包含一個磁珠和一個*片段的微反應(yīng)器,。
4)乳液PCR擴(kuò)增:每個*的片段在自己的微反應(yīng)器里進(jìn)行獨(dú)立的擴(kuò)增,,而沒有其他的競爭性或者污染性序列的影響,。整個片段文庫的擴(kuò)增平行進(jìn)行,。對于每一個片段而言,擴(kuò)增后產(chǎn)生了幾百萬個相同的拷貝,。隨后,,乳液混合物被打破,擴(kuò)增的片段仍然結(jié)合在磁珠上,。
5)一個磁珠=一條讀長:攜帶DNA的捕獲磁珠隨后放入“Pico TiterPlate"(PTP)板中進(jìn)行后繼的測序,。PTP孔的直徑(29um)只能容納一個磁珠(20um)。然后將PTP板放置在GS FLX中,,測序開始,。放置在四個單獨(dú)的試劑瓶里的四種堿基,依照T,、A,、C、G的順序依次循環(huán)進(jìn)入PTP板,,每次只進(jìn)入一個堿基,。如果發(fā)生堿基配對,就會釋放一個焦磷酸,。這個焦磷酸在ATP硫酸化酶和螢光素酶的作用下,,經(jīng)過一個合成反應(yīng)和一個化學(xué)發(fā)光反應(yīng),,zui終將螢光素氧化成氧化螢光素,同時釋放出光信號,。此反應(yīng)釋放出的光信號實(shí)時被儀器配置的高靈敏度CCD相機(jī)捕獲到,。有一個堿基和測序模板進(jìn)行配對,就會捕獲到一分子的光信號,;由此一一對應(yīng),,就可以準(zhǔn)確、快速地確定待測模板的堿基序列,。這也就是大名鼎鼎的焦磷酸測序,。
6)數(shù)據(jù)分析:GS FLX系統(tǒng)在10小時的運(yùn)行當(dāng)中可獲得100多萬個讀長,讀取超過4-6億個堿基信息,。GS FLX 系統(tǒng)提供兩種不同的生物信息學(xué)工具對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,,適用于不同的應(yīng)用:達(dá)400 MB的從頭拼接和任何大小基因組的重測序。
GS FLX系統(tǒng)的準(zhǔn)確率在99%以上,。其主要限制來自同聚物,,也就是相同堿基的連續(xù)摻入,如AAA或GGG,。由于沒有終止元件來阻止單個循環(huán)的連續(xù)摻入,,同聚物的長度就需要從信號強(qiáng)度中推斷出來。這個過程就可能產(chǎn)生誤差,。因此,,454測序平臺的主要錯誤類型是插入-缺失,而不是替換,。

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