關(guān)鍵詞:多肽合成技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)
簡介：世界*品牌多肽合成技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)原裝，質(zhì)量保證,*,。
多肽合成技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系。
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產(chǎn)品品牌：   http://www.。,。ｃｏｍ/goodsid/fenleiyi/2868603/1.html    
測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程：
多肽是一種與生物體內(nèi)各種細(xì)胞功能都相關(guān)的生物活性物質(zhì),，它的分子結(jié)構(gòu)介于氨基酸和蛋白質(zhì)之間，是由多種氨基酸按照一定的排列順序通過肽鍵結(jié)合而成的化合物,。多肽是涉及生物體內(nèi)各種細(xì)胞功能的生物活性物質(zhì)的總稱,，常常被應(yīng)用于功能分析、抗體研究,、尤其是藥物研發(fā)等領(lǐng)域,。
具體合成由下列幾個(gè)循環(huán)組成：
1） 去保護(hù)：Fmoc保護(hù)的柱子和單體必須用一種堿性溶劑（piperidine）去 除氨基的保護(hù)基團(tuán)。
2） 激活和交聯(lián)：下一個(gè)氨基酸的羧基被一種活化劑所活化,?；罨膯误w與游離的氨基反應(yīng)交聯(lián)，形成肽鍵,。在此步驟使用大量的超濃度試劑驅(qū)使反應(yīng)完成,。循環(huán)：這兩步反應(yīng)反復(fù)循環(huán)直到合成完成。
3） 洗脫和脫保護(hù)：多肽從柱上洗脫下來,，其保護(hù)基團(tuán)被一種脫保護(hù)劑（TFA） 洗脫和脫保護(hù),。
試劑檢測(cè)：沒有選購在線檢測(cè)附件的多肽合成儀用戶，也可以采用試劑檢測(cè)方法做基本的耦合效果測(cè)定實(shí)驗(yàn),。
固相多肽合成中,，主要是通過檢測(cè)樹脂上游離氨基來判斷連接效率，檢測(cè)方法稱為Kaiser方法,，其檢測(cè)結(jié)果,，如果有游離氨基的時(shí)候，顯示蘭色,，或紅褐色（pro,，ser,，His）。
Kaiser試劑包括：A,，6% 茚三酮的乙醇溶液,；B，80% 苯酚的乙醇溶液,；C,，2% 0.001M KCN的吡啶溶液
配制中的吡啶需要經(jīng)過茚三酮處理后，重蒸后再使用,。檢測(cè)過程,，取少量樹脂，加入A,，B,，C各2-3滴，100℃下加熱1-2min,，如果溶液有蘭色,，或樹脂出現(xiàn)蘭色，紅褐色,，表明還有游離氨基,，否則說明連接*。
其它檢測(cè)游離氨基的方法：三硝基苯磺酸法,，苦味酸法,，溴芬蘭法等.
氨基酸保護(hù)基 
20種常見氨基酸，根據(jù)側(cè)鏈可以分為幾類：脂肪族氨基酸（Ala,，Gly，Val,，Leu,，Ile，）,，芳香族氨基酸（Phe,，Tyr，Trp,，His）,，酰胺或羧基側(cè)鏈氨基酸（Asp，Glu,，Asn,，Gln），堿性側(cè)鏈氨基酸（Lys,，Arg）,，含硫氨基酸（Cys,，Met），含醇氨基酸（Ser,，Thr）,，亞氨型基酸（Pro）。多肽化學(xué)合成中氨基酸的保護(hù)非常關(guān)鍵,，直接決定了合成能夠成功的關(guān)鍵,。因?yàn)槌Ｒ姷?0中氨基酸中有很多都是帶有活性側(cè)鏈的，需要進(jìn)行保護(hù),，一般要求,，這些保護(hù)基在合成過程中穩(wěn)定，無副反應(yīng),，合成結(jié)束后可以*定量的脫除,。合成中需要進(jìn)行保護(hù)的氨基酸包括：Cys，Asp,，Glu,，His，Lys,，Asn,，Gln，Arg,，Ser,，Thr，Trp,，Tyr,。需要進(jìn)行保護(hù)的基團(tuán)：羥基，羧基,，巰基,，氨基，酰胺基,，胍基,，吲哚，咪唑等,。其中Trp也可以不保護(hù),，因?yàn)檫胚嵝再|(zhì)比較穩(wěn)定。當(dāng)然在特殊的情況下,，有些氨基酸也可以不保護(hù),，象，Asn，Gln ,，Thr,，Tyr。
多肽縮合試劑 
目前多肽合成中,，主要采用羧基活化方法來完成接肽反應(yīng),，zui早使用的是將氨基酸活化為酰氯，疊氮,，對(duì)稱酸酐以及混合酸酐的方法,，但是由于這些條件下，存在氨基酸消旋,，以及反應(yīng)試劑危險(xiǎn)以及制備比較復(fù)雜,，逐漸被后來的縮合試劑取代，按照其結(jié)構(gòu)可以分為兩種：縮合試劑主要有：碳二亞胺型,，鎓鹽型（Uronium）,。 
液相多肽合成（solution phase synthesis） 
液相多肽合成現(xiàn)在仍然廣泛的使用，在合成短肽和多肽片段上具有合成規(guī)模大,，合成成本低的顯著優(yōu)點(diǎn),，而且由于是在均相中進(jìn)行反應(yīng)，可以選擇的反應(yīng)條件更加豐富,，象一些催化氫化,，堿性水解等條件，都可以使用,，這在固相中,，使用卻由于反應(yīng)效率低，以及副反應(yīng)等原因,，無法應(yīng)用,。液相多肽合成中主要采用BOC和Z兩種反應(yīng)策略。 
合成多肽分析鑒定方法 
多肽的分析鑒定方法有多肽一級(jí)結(jié)構(gòu),，二級(jí)結(jié)構(gòu)鑒定,，多肽一級(jí)結(jié)構(gòu)包括：質(zhì)譜分析，氨基酸組成分析,，氨基酸序列分析,。二級(jí)結(jié)構(gòu)包括：圓二色譜（CD）,，NMR,，X-衍射等方法。 
純度分析 
多肽的純度分析,，一般都采用HPLC進(jìn)行分析,，選擇RP-C18，粒徑5μm，孔徑300A,，4.6×150mm,，流動(dòng)相：A，0.1% TFA/H2O,；B,，0.1% TFA/ACN，洗脫梯度,，5%B--65%B,，時(shí)間30min。也有些多肽,，特別是短肽,，由于親水性強(qiáng)，在C18上保留很弱,，需要改變條件,，這里主要有兩種方法：一個(gè)改變分析梯度，可以將起始梯度改為2%,，等度或小梯度洗脫,；另外一個(gè)方法是在流動(dòng)相中加入強(qiáng)離子對(duì)試劑，如七氟丁酸,，十八烷基磺酸鈉等,。 
質(zhì)譜分析 
質(zhì)譜分析的目的主要是確證分子量，當(dāng)然采用MS/MS可以部分的了解多肽序列的信息,，但是這個(gè)需要比較全的數(shù)據(jù)庫作為基礎(chǔ),，分析才能比較準(zhǔn)確。由于多肽性質(zhì)不穩(wěn)定,，需要采用軟電離技術(shù),，目前多肽分析主要使用了電噴霧（ESI-MS），基質(zhì)輔助激光解吸（MALDI-MS）,。其中ESI-MS通常會(huì)給出多電荷峰,，電荷數(shù)目和多肽序列上氨基，胍基,，咪唑基的數(shù)目有關(guān),，因此，經(jīng)常給出了雙電荷,，三電荷等離子峰,。MALDI-MS可以分析蛋白大分子，而且通常情況下很少帶多電荷,，因此數(shù)據(jù)直接對(duì)應(yīng)了分子離子峰,，容易分析,。此外，通常在分析長肽或蛋白過程中,，需要添加NH4,，Na，K等離子,，提高靈敏度,，所以一般在 MS中出現(xiàn)一組峰，分別對(duì)應(yīng)：（M+H）+,，（M+NH4）+,，（M+Na）+，（M+K）+,。 
氨基酸組成分析 
氨基酸組成分析一般需要產(chǎn)品的純度較高,，它可以給出多肽中氨基酸的種類，數(shù)目,。分析過程首先通過酸水解破壞肽鍵,，典型酸水解的條件是：真空條件下，110℃,，用6M鹽酸水解16至72小時(shí),。酸水解雖然很有用，但酸水解條件下不能獲得完整的氨基酸分析,，因?yàn)樘於０泛凸劝滨０返膫?cè)鏈含有酰胺鍵,，用于切斷蛋白質(zhì)肽鍵的酸也可以將天冬酰胺轉(zhuǎn)換為天冬氨酸，谷氨酰胺轉(zhuǎn)換為谷氨酸,。由于水解溫度比較高,，色氨酸的吲哚環(huán)容易被空氣氧化，即使在密封的管中,，色氨酸的吲哚環(huán)也幾乎都被破壞了,。因此蛋白質(zhì)的色氨酸含量往往是通過它的紫外吸收光譜估計(jì)的，也可以通過堿水解分析色氨酸的含量,。半胱氨酸在酸水解中也不能測(cè)定,，要測(cè)量需要在蛋白質(zhì)水解之前進(jìn)行氧化或羧甲基化，形成的衍生物在酸水解之后才能定量,。
多肽要在幾分鐘內(nèi)高度被分析,。
HPLC分兩類:離子交換和反相。離子交換HPLC依靠多肽和固相間的直接電荷相互作用,。柱子在一定PH范圍帶有特定電荷衍變成一種離子體,，而多肽或多肽混合物，由其氨基酸組成表現(xiàn)出相反電荷,。 分離是一種電荷相互作用,，通過可變PH， 離子強(qiáng)度,， 或兩者洗脫出多肽,，通常，先用低離子強(qiáng)度的溶液,，以后逐漸加強(qiáng)或一步一步加強(qiáng),，直到多肽從柱中洗脫出。離子交換分離的一個(gè)例子使用強(qiáng)陽離子交換柱,。如sulfoethylaspartimide通過酸性PH中帶正電來分離,。
反相HPLC條件與正常層析正相反。多肽通過疏水作用連到柱上,，用降低離子強(qiáng)度洗脫,，如增加洗脫劑的疏水性。通常柱子由共價(jià)吸附到硅上的碳?xì)渫殒湗?gòu)成,，這種鏈長度為G4-G8碳原子,。由于洗脫是一種疏水作用。大的疏水肽用短鏈柱洗脫好,。 然而,，總體實(shí)踐中， 這兩類柱互變無多少顯著差別,，別類載體由碳水化合物構(gòu)成,， 比如苯基。
典型的操作常由兩綬沖劑組成,，0.1%TFA-H2o和80% acetonitrile0.1%TFA--H2o稀acetonitrile,。用線型梯變以每分鐘0.5%到1.0%改變的速度混合。常見分析和純化用柱為4.6×250mm(3-10μ m)和22×250mm(10μ m). 如果用徑向填柱,，那么大小是8×100(3-10μm)和25×250mm(10μ m),。
大量各種緩沖劑含許多不同試劑，比如heptafluorobutyric酸,，0.1%磷酸,，稀He formic酸(5-6%, pH2-4), 10-100mM NH4HCO3,醋酸鈉/氨，TFA/TEA,，磷酸鈉或鉀,，異戊酚。這樣許多不同組合可形成緩沖劑,，但要注意一點(diǎn):硅反相柱料不能長時(shí)間暴露于高pH,，甚至微堿pH，因?yàn)檫@樣會(huì)破壞柱子,。