關(guān)鍵詞:多肽合成與修飾|實驗技術(shù)服務(wù)
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多肽合成與修飾|實驗技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達體系。
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測序?qū)嶒灹鞒蹋?br>多肽是一種與生物體內(nèi)各種細胞功能都相關(guān)的生物活性物質(zhì),，它的分子結(jié)構(gòu)介于氨基酸和蛋白質(zhì)之間，是由多種氨基酸按照一定的排列順序通過肽鍵結(jié)合而成的化合物,。多肽是涉及生物體內(nèi)各種細胞功能的生物活性物質(zhì)的總稱,，常常被應(yīng)用于功能分析、抗體研究,、尤其是藥物研發(fā)等領(lǐng)域,。
具體合成由下列幾個循環(huán)組成：
1） 去保護：Fmoc保護的柱子和單體必須用一種堿性溶劑（piperidine）去 除氨基的保護基團。
2） 激活和交聯(lián)：下一個氨基酸的羧基被一種活化劑所活化,?；罨膯误w與游離的氨基反應(yīng)交聯(lián)，形成肽鍵,。在此步驟使用大量的超濃度試劑驅(qū)使反應(yīng)完成,。循環(huán)：這兩步反應(yīng)反復(fù)循環(huán)直到合成完成,。
3） 洗脫和脫保護：多肽從柱上洗脫下來，其保護基團被一種脫保護劑（TFA） 洗脫和脫保護,。
試劑檢測：沒有選購在線檢測附件的多肽合成儀用戶,，也可以采用試劑檢測方法做基本的耦合效果測定實驗,。
固相多肽合成中,，主要是通過檢測樹脂上游離氨基來判斷連接效率，檢測方法稱為Kaiser方法,，其檢測結(jié)果,，如果有游離氨基的時候，顯示蘭色,，或紅褐色（pro,，ser，His）,。
Kaiser試劑包括：A,，6% 茚三酮的乙醇溶液；B,，80% 苯酚的乙醇溶液,；C，2% 0.001M KCN的吡啶溶液
用線型梯變以每分鐘 0.5% 到 1.0% 改變的速度混合,。常見分析和純化用柱為 4.6× 250mm (3-10μ m) 和 22× 250mm (10μ m). 如果用徑向填柱,，那么大小是 8×100 ( 3-10μ m )和 25× 250mm (10μ m)大量各種緩沖劑含許多不同試劑，比如 heptafluorobutyric 酸,， 0.1% 磷酸,， 稀 Heformic 酸 (5-6%, pH2-4), 10 -100mM NH4HCO3, 醋酸鈉 / 氨， TFA/TEA ,，磷酸鈉或鉀,，異戊酚。這樣許多不同組合可形成緩沖劑,，但要注意一點：硅反相柱料不能長時間暴露于高 pH ,，甚至微堿 pH ， 因為這樣會破壞柱子一般多肽分離拿150mm的柱子就可以了,，250mm在分離度上改善不大,，因為多肽的分離機理和小分子不同。小分子是通過液液交換,，所以柱子越長交換越充分,，分離度也越高。
Asp和Glu 
Asp和Glu側(cè)鏈羧基常用t-Bu保護.可用TFA,、TMSBr等脫除.但是用t-Bu保護仍有側(cè)鏈環(huán)化形成酰亞胺的副反應(yīng)發(fā)生.近年來,，發(fā)展了一些新的保護基如環(huán)烷醇酯,、金剛烷醇酯等可減輕這一副反應(yīng)，這些保護基可用TMSOTf(三氟甲磺酸*硅烷酯)除去.
Ser,、Thr和Tyr
ser,、Thr的羥基及Tyr的酚羥基通常用t-Bu保護.叔丁基的引入比較麻煩，首先ser制成芐氧羰基酯,，再在酸催化下與異丁烯反應(yīng).Ser和Thr還可用芐基保護,，Ser用芐醇引入芐基、Thr用溴芐引入芐基.
Asn和Gln 
Asn和Gln側(cè)鏈的酰胺鍵在肽合成中一般不加以保護.但合成大肽時,，Asn和Gln的α-羧基活化時可能會發(fā)生分子內(nèi)脫氫反應(yīng)生成氰基化合物.堿性時Gln的側(cè)鏈可以環(huán)化生成酰胺.而且不保護的Fmoc-Gln和Fmoc-Asn在DCM中溶解度很差.為了避免這些問題,，可以用9-咕噸基，2,，4,，6-*氧芐基，4,，4′―二甲氧二苯甲基或三苯甲基等保護,，這四種基因均可用TFA脫除.
His 
His是zui容易發(fā)生消旋化的氨基酸，必須加以保護.
對咪唑環(huán)的非π-N開始用芐基(Bzl)和甲基磺?；?TOS)保護.但這兩種保護基均不太理想.TOS對親核試劑不穩(wěn)定,，Bzl需要用氫解或Na/NHs除去，并且產(chǎn)生很大程度消旋.Boc基團是一個較理想的保護基,，降低了咪唑環(huán)的堿性,，抑制了消旋，成功地進行了一些合成.但是當反復(fù)地用堿處理時,，也表現(xiàn)出一定的不穩(wěn)定性在堿中穩(wěn)定,，但是沒能很好地抑制消旋，而且脫保護時要用很強的親核試劉如.
對咪唑環(huán)π-N保護,，可以*抑制消旋,，π-N可以用芐氧甲基(Bom)和叔丁氧甲基(Bum)保護，(Bum)可以用TFA脫除,，Bom更穩(wěn)定些,，需用催化氫解或強酸脫保護，Bum是目前很有發(fā)展前途的His側(cè)鏈保護基,，其不足之處在于Fmoc(His)Bum在DCM和DMF中的溶解度較差.
Cys 
Cys的-SH具有強親核性,，易被酰化成硫醚,，也易被氧化為二硫鍵,，必須加以保護.常用保護基有三類:一類用TFA可脫除，如對甲芐基,、對甲氧芐基和三苯甲基等;第二類可用(CF3CO)3T1/TFA脫除,，對TFA穩(wěn)定.如t-Bu,、Bom和乙酰胺甲基等.第三類對弱酸穩(wěn)定，如芐基和叔丁硫基(stBu)等,，Cys(StBu)可用巰基試劑和磷試劑還原,，Cys(Bzl)可用Na/NH3(1)脫保護.
Arg 
Arg的胍基具有強親核性和堿性，必須加以保護.理想的情況是三個氮都加以保護,，實際上保護1或2個胍基氮原子.保護基分四類:(1)硝基(2)烷氧羰基(3)磺?；?4)三苯甲基.
硝基在制備、?；呀庵挟a(chǎn)生很多副反應(yīng),，應(yīng)用不廣.烷氧羰基應(yīng)主要有Boc和二金剛烷氧羰基(Adoc)2,、Fmoc(Arg)Boc的耦聯(lián)反效率不高,，理時不處穩(wěn)定，會發(fā)生副反應(yīng);Adoc保護了兩個非π-N,，但有同樣的副反應(yīng)發(fā)生.對磺?；Ｗo，其中TOS應(yīng)用zui廣,，但它較難脫除.近年來2,，3，6-*基-4-甲氧苯橫?；?Mtr)較受歡迎,，在TFA作用下，30分鐘即可脫除,，但是它們都不能*抑制側(cè)鏈的?；l(fā)生.三苯甲基保護基可用TFA脫除.缺點是反應(yīng)較慢，側(cè)鏈仍有?；磻?yīng),，且其在DCM、DMF中溶解度不好.
Lys 
Lys的ε-NH2必須加以保護.但與α-NH2的保護方式應(yīng)不同,，該保護基要到肽鏈合成后除去.ε-NH2的保護無消旋問題,，可以采用酰基保護基,，其它常用的保護基有芐氧碳基
Fmoc基團的脫除 
Fmoc基團的芴環(huán)系的吸電子作用使9-H具有酸性,，易被較弱堿除去，反應(yīng)條件很溫和.反應(yīng)過程可表示如下:進攻9-H,β消除形成二苯芴烯,，很容易被二級環(huán)胺進攻形成穩(wěn)定的加成物.Fmoc基團對不同的堿穩(wěn)定性不同,，可根據(jù)實際條件選用.