關(guān)鍵詞:半定量RT-PCR服務(wù)|實驗技術(shù)服務(wù)
簡介：世界*品牌半定量RT-PCR服務(wù)|實驗技術(shù)服務(wù)原裝,，質(zhì)量保證,*。
半定量RT-PCR服務(wù)|實驗技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達體系,。
我們具備豐富的蛋白表達設(shè)計經(jīng)驗及實驗操作技巧,，承諾客戶不成功不收費,。在獲得重組蛋白產(chǎn)品的同時，我們也會提供相應的原始數(shù)據(jù)和原始圖片,不需要再額外花費精力重復實驗,。另一方面,，我們所有的實驗數(shù)據(jù)真實可信，我們提供原始的表達菌株和克隆質(zhì)粒,，客戶可以依據(jù)我們的實驗報告重復我們的實驗結(jié)果,。
產(chǎn)品品牌： http://www.。,。ｃｏｍ/goodsid/fenleiyi/2868603/1.html
測序?qū)嶒灹鞒蹋?br>半定量RT-PCR一般是在沒有條件做 實時PCR 的情況下使用,，用于測定體內(nèi)目的基因的表達增加減少與否，即通過目的基因跑出來的電泳帶與管家基因(如β-actin)的電泳帶的相對含量比較,，觀測目的基因表達增減,，另外還要做一個β-actin的內(nèi)參照對照。
1 樣品RNA的抽提
①取凍存已裂解的細胞,，室溫放置5分鐘使其*溶解,。
②兩相分離 每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的氯仿，蓋緊管蓋,。手動劇烈振蕩管體15秒后,，15到30℃孵育2到3分鐘,。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相,，中間層以及無色水相上層,。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%,。
③RNA沉淀 將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無RNA酶的離心管中,。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后15到30℃孵育10分鐘后,，于4℃下12000rpm 離心10分鐘。此時離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊,。
④RNA清洗 移去上清液,，每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀,?；靹蚝螅?℃下7000rpm離心5分鐘,。
⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液,，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。
⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA時,，先加入無RNA酶的水40μl用槍反復吹打幾次,，使其*溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用,。
2 RNA質(zhì)量檢測
1）紫外吸收法測定
先用稀釋用的TE溶液將分光光度計調(diào)零,。然后取少量RNA溶液用TE稀釋（1:100）后，讀取其在分光光度計260nm和280nm處的吸收值,，測定RNA溶液 濃度和純度,。
① 濃度測定
A260下讀值為1表示40 μg RNA/ml。樣品RNA濃度(μg/ml)計算公式為：A260 ×稀釋倍數(shù)× 40 μg/ml,。具體計算如下：
RNA溶于40 μl DEPC水中,，取5ul，1:100稀釋至495μl的TE中,，測得A260 = 0.21
RNA 濃度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或 0.84 μg/μl
取5ul用來測量以后,，剩余樣品RNA為35 μl，剩余RNA總量為：
35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg
②純度檢測
RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度,，比值范圍1.8到2.1,。
2）變性瓊脂糖凝膠電泳測定
①制膠
1g瓊脂糖溶于72ml水中，冷卻至60℃,，10 ml的10× MOPS電泳緩沖液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M),。
10×MOPS電泳緩沖液
濃度 成分
0.4M MOPS,，pH 7.0
0.1M 乙酸鈉
0.01M EDTA
灌制凝膠板，預留加樣孔至少可以加入25 μl溶液,。膠凝后取下梳子,，將凝膠板放入電泳槽內(nèi)，加足量的1×MOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個毫米,。
②準備RNA樣品
取3μgRNA,，加3倍體積的甲醛上樣染液，加EB于甲醛上樣染液中至終濃度為10μg/ml,。加熱至70℃孵育15分鐘使樣品變性,。
③電泳
上樣前凝膠須預電泳5min，隨后將樣品加入上樣孔,。5–6V/cm電壓下2h,，電泳至溴酚蘭指示劑進膠至少2–3cm。
3,待測樣品的待測基因?qū)崟r定量PCR
①所有cDNA樣品分別配置實時定量 PCR反應體系,。
體系配置如下：
序號 反應物 劑量
1 SYBR Green 1 染料 10 ul
2 上游引物 1ul
3 下游引物 1ul
4 dNTP 1ul
5 Taq聚合酶 2ul
6 待測樣品cDNA 5ul
7 ddH2O 30ul
8 總體積 50 ul
輕彈管底將溶液混合,，6000rpm短暫離心。
②將配制好的PCR反應溶液置于Realtime PCR儀上進行PCR擴增反應,。反應條件為：93℃2分鐘預變性,，然后按93℃ 1分鐘，55℃1分鐘,，72℃1分鐘,，共40做個循環(huán)，zui后72℃7分鐘延伸,。
4, 實時定量PCR使用引物列表
引物設(shè)計軟件：Primer Premier 5.0,，并遵循以下原則：引物與模板的序列緊密互補；引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu),；引物不在模板的非目的位點引發(fā)DNA 聚合反應(即錯配),。
