關(guān)鍵詞:半定量RT-PCR技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)
簡(jiǎn)介：世界*品牌半定量RT-PCR技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)原裝,，質(zhì)量保證,*,。
半定量RT-PCR技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系,。
我們具備豐富的蛋白表達(dá)設(shè)計(jì)經(jīng)驗(yàn)及實(shí)驗(yàn)操作技巧,，承諾客戶不成功不收費(fèi),。在獲得重組蛋白產(chǎn)品的同時(shí),，我們也會(huì)提供相應(yīng)的原始數(shù)據(jù)和原始圖片,不需要再額外花費(fèi)精力重復(fù)實(shí)驗(yàn),。另一方面,，我們所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)真實(shí)可信，我們提供原始的表達(dá)菌株和克隆質(zhì)粒,，客戶可以依據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)報(bào)告重復(fù)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,。
產(chǎn)品品牌： http://www.。,。ｃｏｍ/goodsid/fenleiyi/2868603/1.html
測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程：
半定量RT-PCR參照的做法一般有兩種:
1) 將要比較的兩個(gè)樣品的BETA-ACTIN 調(diào)成一樣的亮度,，然后就可以直接比較目的基因的亮度了。方法的結(jié)果比較直觀,，但較費(fèi)事,。
2) 不進(jìn)行調(diào)平，一個(gè)樣品里將目的基因和BETA-ACTIN直接比較,，用軟件就可以做到,，然后將不同樣品的這個(gè)比值進(jìn)行比較就可以了。方法比較簡(jiǎn)單,，但結(jié)果不夠直觀,。
1.每個(gè)標(biāo)本都要做自己的內(nèi)參，不能用同一個(gè)內(nèi)參!
2.每個(gè)標(biāo)本在實(shí)際做前都要摸*循環(huán)數(shù),，包括內(nèi)參,，但內(nèi)參的循環(huán)數(shù)不一定要和目的基因一樣，都要選擇上升期的中間數(shù)作為*循環(huán)數(shù),，否則進(jìn)入平臺(tái)期就沒(méi)有可比性了!所以內(nèi)參要有它自己的*循環(huán)數(shù)!
3.電泳掃描后,，計(jì)算灰度值，先用同一標(biāo)本的內(nèi)參和目的進(jìn)行比較,，然后用這個(gè)相對(duì)值再去和其他你所要比較的平行組進(jìn)行比較,，一般每組4個(gè)樣本以上,。
1 樣品RNA的抽提
①取凍存已裂解的細(xì)胞，室溫放置5分鐘使其*溶解,。
②兩相分離 每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的氯仿,，蓋緊管蓋。手動(dòng)劇烈振蕩管體15秒后,，15到30℃孵育2到3分鐘,。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相,，中間層以及無(wú)色水相上層,。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時(shí)加入的TRIZOL試劑的60%,。
③RNA沉淀 將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無(wú)RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA,，混勻后15到30℃孵育10分鐘后,，于4℃下12000rpm 離心10分鐘。此時(shí)離心前不可見(jiàn)的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊,。
④RNA清洗 移去上清液,，每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀,?；靹蚝螅?℃下7000rpm離心5分鐘,。
⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液,，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。
⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA時(shí),，先加入無(wú)RNA酶的水40μl用槍反復(fù)吹打幾次,，使其*溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用,。
2 RNA質(zhì)量檢測(cè)
1）紫外吸收法測(cè)定
先用稀釋用的TE溶液將分光光度計(jì)調(diào)零,。然后取少量RNA溶液用TE稀釋（1:100）后，讀取其在分光光度計(jì)260nm和280nm處的吸收值,，測(cè)定RNA溶液 濃度和純度,。
① 濃度測(cè)定
A260下讀值為1表示40 μg RNA/ml。樣品RNA濃度(μg/ml)計(jì)算公式為：A260 ×稀釋倍數(shù)× 40 μg/ml,。具體計(jì)算如下：
RNA溶于40 μl DEPC水中,，取5ul，1:100稀釋至495μl的TE中,，測(cè)得A260 = 0.21
RNA 濃度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或 0.84 μg/μl
取5ul用來(lái)測(cè)量以后,，剩余樣品RNA為35 μl,，剩余RNA總量為：
35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg
②純度檢測(cè)
RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度，比值范圍1.8到2.1,。
2）變性瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定
①制膠
1g瓊脂糖溶于72ml水中,，冷卻至60℃，10 ml的10× MOPS電泳緩沖液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M),。
10×MOPS電泳緩沖液
濃度 成分
0.4M MOPS,，pH 7.0
0.1M 乙酸鈉
0.01M EDTA
灌制凝膠板，預(yù)留加樣孔至少可以加入25 μl溶液,。膠凝后取下梳子,，將凝膠板放入電泳槽內(nèi)，加足量的1×MOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個(gè)毫米,。
②準(zhǔn)備RNA樣品
取3μgRNA,，加3倍體積的甲醛上樣染液，加EB于甲醛上樣染液中至終濃度為10μg/ml,。加熱至70℃孵育15分鐘使樣品變性,。
③電泳
上樣前凝膠須預(yù)電泳5min，隨后將樣品加入上樣孔,。5–6V/cm電壓下2h,，電泳至溴酚蘭指示劑進(jìn)膠至少2–3cm。
3,待測(cè)樣品的待測(cè)基因?qū)崟r(shí)定量PCR
①所有cDNA樣品分別配置實(shí)時(shí)定量 PCR反應(yīng)體系,。
體系配置如下：
序號(hào) 反應(yīng)物 劑量
1 SYBR Green 1 染料 10 ul
2 上游引物 1ul
3 下游引物 1ul
4 dNTP 1ul
5 Taq聚合酶 2ul
6 待測(cè)樣品cDNA 5ul
7 ddH2O 30ul
8 總體積 50 ul
輕彈管底將溶液混合,，6000rpm短暫離心。
②將配制好的PCR反應(yīng)溶液置于Realtime PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng),。反應(yīng)條件為：93℃2分鐘預(yù)變性,，然后按93℃ 1分鐘，55℃1分鐘,，72℃1分鐘,，共40做個(gè)循環(huán)，zui后72℃7分鐘延伸,。
4, 實(shí)時(shí)定量PCR使用引物列表
引物設(shè)計(jì)軟件：Primer Premier 5.0,，并遵循以下原則：引物與模板的序列緊密互補(bǔ)；引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu),；引物不在模板的非目的位點(diǎn)引發(fā)DNA 聚合反應(yīng)(即錯(cuò)配),。
