Script III miRNA 1st Stand Synthesis Kit 增強型miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒（加尾法）

miRNA1stStandSynthesisKit 反轉錄試劑

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產品內容

保存條件

-20℃保存,，有效期 12 個月,。

具體產品的參數(shù)以收到產品說明書的參數(shù)為準  

產品簡介

Script III miRNA 1st Stand Synthesis Kit 采用Poly(A)加尾法原理,， 首先miRNA 3’末端加Poly(A)尾,，再使用Anchored oligo(dT)-universaltag通用逆轉錄引物進行逆轉錄反應，最終生成miRNA 對應的cDNA 第一鏈,。

本產品采用特殊優(yōu)化預混合miRNA RT Enzyme Mix,，將Poly(A)加尾和反轉錄合并為一步完成，簡化了操作步驟并提高了Poly(A)加尾和逆轉錄效率,。

本產品具有可從20pg-2μg 的Total RNA中高效制備miRNA對應的cDNA 第一鏈,。一次合成的cDNA可檢測多個microRNA，節(jié)約了RNA樣品和成本,。

注意事項

1． 為保證反轉錄成功,，建議使用高質量的RNA樣品，以及避免RNase污染,。

2． 在反應中使用的total RNA 必須包含有小分子RNA(miRNA),。此過程也可以使用富集的miRNA,， 單純miRNA無法直接用分光光度計定量，建議直接加入2μl ~5μl,?？筛鶕康膍iRNA豐度決定加入量，但是對于低豐度miRNA 樣品而言(如血清血漿提取物),，可直接加入最大體積8 μl,。

3． miRNA RT Enzyme Mix比較粘稠，容易吸附在管壁和吸頭外,，導致?lián)p失,，使用前請點甩離心后取用。miRNA RT Enzyme Mix包含的酶是過量的,，即使每次分別按照1.8 μl使用，也不影響使用效果,。

miRNA 第一連 cDNA 合成 (以 20 μl 反應體系為例)

重要提示：操作前,，請將各組分輕彈混勻，點甩離心后置冰上備用,。

1． 反應體系的配制 (先加其他組分,，最后再加入miRNA RT Enzyme Mix)于冰上，在PCR管中,，加入以下組分：

輕柔吸打混勻，點甩離心,，收集溶液至管底,。

2． 42℃孵育60 min,，進行miRNA 3’末端Poly (A)加尾和逆轉錄反應。

3． 85°C加熱5 sec,，終止反應,。

逆轉錄產物可立即用于qPCR反應，或保存于-20°C,，并在半年內使用,；長期存放，請分裝后存于-70°C,。

qPCR

推薦按照金百特生物的miRNA Real-Time PCR Assay kit （Cat#P419）進行定量實驗,。

按照上述操作步驟得到的cDNA模板，用于下游PCR或者熒光定量PCR檢測時,，可以根據實際情況選擇使用量,，對于特殊的檢測體系中,，高含量的cDNA模板易導致非特異性擴增，可根據所檢測miRNA 的豐度適當?shù)南♂宑DNA（5-10倍或者100倍）后使用,。如果發(fā)現(xiàn)有非特異擴增條帶,，或者融鏈曲線顯示有非特異擴增，往往提示cDNA模板過量,，可以嘗試將上述cDNA模板稀釋幾十到幾百倍甚至上千倍再使用,。

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