Script III 1st Strand cDNA Synthesis Kit（With dsDNase）（for PCR or qPCR）

1stStrandcDNASynthesisKit 反轉(zhuǎn)錄試劑

目錄號(hào)：71118

產(chǎn)品內(nèi)容

保存條件：-20℃保存,，有效期 12 個(gè)月,。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準(zhǔn)

產(chǎn)品簡介

Script III 1st Strand cDNA Synthesis Kit（With dsDNase）采用第三代高效逆轉(zhuǎn)錄酶,，具有更強(qiáng)的延伸能力和穩(wěn)定性,，并配備了具有DNA分解活性的特殊dsDNase，只需一步操作,， 即可同時(shí)完成基因組清除與逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),，操作方便快捷，可用于長達(dá)12kb的cDNA合成以及高比例的全長cDNA文庫的構(gòu)建等,。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可以用于PCR,，克隆基因；也可以用于qPCR,，兼容染料法和探針法,，用來檢測(cè)高拷貝或低拷貝基因。

Oligo(dT)18 和Random primer (N6)是獨(dú)立組分,，可以自由選用,，以獲得最佳的逆轉(zhuǎn)錄結(jié)果！

引物的選擇：

1. 如果RNA模板來源于真核生物,，shou選Oligo (dT),，與真核生物mRNA的3’PolyA尾配對(duì)，可獲得最高產(chǎn)量的全長cDNA,。

2. 如果對(duì)一些物種,，不能確定mRNA是否有polyA尾的情況下，shou選Oligo(dT),，不成功再嘗試基因特異性引物(GSP)和Random primer為引物,。

3. 基因特異性引物(GSP)的特異性較高。但有些情況下,，用于PCR反應(yīng)的GSP無法有效引導(dǎo)第一鏈cDNA合成,，可改用Oligo (dT)或Randomprimer重新進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。

4. Random primer特異性最di,，所有RNA，包括mRNA,，rRNA,，tRNA均可以作為Random primer的模板。當(dāng)目標(biāo)區(qū)域具有復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)或GC含量較高，或者模板為原核生物來源,，使用Oligo (dT)或基因特異性引物(GSP)無法有效引導(dǎo)cDNA合成時(shí),，可使用Random primer為引物。

5. 如果合成cDNA下游用于qPCR,，可將Oligo (dT)與Random primer混合使用（各加1μl /20μl反應(yīng)體系）,，可使mRNA的各個(gè)區(qū)域cDNA合成效率相同，有助于提高qPCR結(jié)果的真實(shí)性和重復(fù)性,。

第一連 cDNA 合成 (以 20 μl 反應(yīng)體系為例)

1．  反應(yīng)體系的配制

操作前,，請(qǐng)將各組分輕彈混勻，點(diǎn)甩離心收集至管底,，置冰上備用,。

使用 RNase-Free PCR 管在冰上配制：

2．輕柔吸打混勻，點(diǎn)甩離心,，置 PCR 儀進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),。

如用Oligo(dT)18或基因特異性引物(GSP)，產(chǎn)物用于PCR：42℃孵育30 min,；

產(chǎn)物用于qPCR：42℃孵育15 min,。

如用 Random Primer,25℃孵育10 min 后，產(chǎn)物用于 PCR,，42℃孵育30 min,；

25℃孵育 10 min 后，產(chǎn)物用于 qPCR,，42℃孵育 15 min,。

注意：如果模板具有復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)或高 GC 區(qū)域，可以先只加 RNA 模板,、 引物和 RNase free H2O,，混勻，65℃變性 5 min,，冰上冷卻,，點(diǎn)甩離心后加入其它成分，并將 42℃孵育溫度提升至 50°C,，有助于提高產(chǎn)量,。

3． 85°C加熱 5 sec，失活RTase和dsDNase,，終止反應(yīng),。

逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可立即用于PCR或qPCR反應(yīng)，或保存于-20°C,，并在半年內(nèi)使用,；長期存放建議分裝后在-70°C保存,，cDNA應(yīng)避免反復(fù)凍融。

PCR

建議取2 - 4 μl的cDNA產(chǎn)物原液作為PCR模板,。

1. 常規(guī)擴(kuò)增：71019-2x Taq PCR MasterMix (30sec/kb)

71800-2x Lightning Taq PCR MasterMix (10sec/kb)

2. 高保真擴(kuò)增：71812-2x FastHiFi PCR MasterMix (≤3kb片段)

71814-2×LongHiFi PCR MasterMix (≤10kb片段)

qPCR

建議取1~2μl cDNA產(chǎn)物原液作為20μl qPCR反應(yīng)體系的模板,。如果基因表達(dá)量較高，請(qǐng)根據(jù)實(shí)際情況適當(dāng)稀釋cDNA模板后使用,。

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