FISH實(shí)驗(yàn)方法及步驟

一.探針變性

將探針在75^oC恒溫水浴中溫育5min,，立即置0^oC,，5～10min，使雙鏈DNA探針變性,。

二.標(biāo)本變性

①將制備好的5-8um的玻片標(biāo)本于50^oC培養(yǎng)箱中烤片2～3h,。（經(jīng)Giemsa染色的標(biāo)本需預(yù)先在固定液中退色后再烤片）。

 ②取出玻片標(biāo)本,，將其浸在70～75^oC的體積分?jǐn)?shù)70％甲酰胺/2×SSC的變性液中變性2～3min,。

 ③立即按順序?qū)?biāo)本經(jīng)體積分?jǐn)?shù)70％、體積分?jǐn)?shù)90％和體積分?jǐn)?shù)100％冰乙醇系列脫水,，每次5min,，然后空氣干燥。

三.雜交

將已變性或預(yù)退火的DNA探針10μL 滴于已變性并脫水的玻片標(biāo)本上,，蓋上18×18蓋玻片,，用Parafilm封片，置于潮濕暗盒中37^oC雜交過夜（約15～17h）,。由于雜交液較少,，而且雜交溫度較高,，持續(xù)時間又長，因此為了保持標(biāo)本的濕潤狀態(tài),，此過程在濕盒中進(jìn)行,。

四.洗脫

此步驟有助于除去非特異性結(jié)合的探針，從而降低本底,。

（1） 雜交次日,，將標(biāo)本從37oC溫箱中取出，用刀片輕輕將蓋玻片揭掉,。

（2） 將已雜交的玻片標(biāo)本放置于已預(yù)熱42～50oC的體積分?jǐn)?shù)50％甲酰胺/2×SSC中洗滌3次,，每次5min。

（3） 在已預(yù)熱42～50^oC的1×SSC中洗滌3次,，每次5min,。

（4） 在室溫下，將玻片標(biāo)本于2×SSC中輕洗一下,。

（5） 取出玻片,，自然干燥。

（6） 取200μL復(fù)染溶液（PI/antifade或DAPI/antifade染液）滴加在玻片標(biāo)本上,，蓋上蓋玻片,。

五.熒光顯微鏡觀察FISH結(jié)果