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杭州實了個驗生物科技有限公司
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羅氏LightCycler® 96 實時熒光定量PCR儀系統(tǒng)詳解
一,、引言
隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time quantitative PCR,，qPCR）已成為基因表達(dá)分析,、病原檢測、突變篩查等領(lǐng)域的重要工具,。羅氏公司開發(fā)的LightCycler® 96 實時熒光定量PCR儀憑借其四通道檢測能力,、靈活的實驗設(shè)置以及友好的軟件界面，在科研和臨床實驗室中得到廣泛應(yīng)用,。本文將從儀器構(gòu)造,、工作原理、技術(shù)特點,、應(yīng)用場景,、操作流程及維護(hù)要點等方面，系統(tǒng)介紹該設(shè)備的性能與使用方法,。
二,、設(shè)備概述
LightCycler® 96 是一款中通量的實時熒光定量PCR儀，可容納96孔標(biāo)準(zhǔn)板,，適合日常分子生物學(xué)實驗的需求,。該系統(tǒng)集成了溫控模塊、光學(xué)檢測系統(tǒng),、控制系統(tǒng)與數(shù)據(jù)分析平臺,，能夠?qū)崿F(xiàn)快速,、準(zhǔn)確的qPCR擴(kuò)增與實時數(shù)據(jù)采集。
主要構(gòu)成包括：
溫控模塊：采用帕爾貼元件（Peltier-based system）進(jìn)行升降溫控制,，溫度梯度小,，確保各孔間的溫度均一性。
光學(xué)檢測系統(tǒng)：搭載四個熒光通道（常用為FAM,、HEX,、ROX、Cy5）,，配有獨立的激發(fā)與檢測光路,，支持多重檢測。
操作界面：通過USB或局域網(wǎng)連接PC,，配套LightCycler® 96軟件進(jìn)行程序設(shè)置與數(shù)據(jù)分析,。
三、技術(shù)參數(shù)
| 項目 | 參數(shù) |
|---|---|
| 孔位格式 | 96孔標(biāo)準(zhǔn)PCR板 |
| 升溫速度 | 最快4.4°C/s |
| 降溫速度 | 最快2.2°C/s |
| 溫控精度 | ±0.2°C |
| 通道數(shù) | 4個熒光通道 |
| 檢測范圍 | 101–10?拷貝 |
| 動態(tài)范圍 | 6–8個數(shù)量級 |
| 檢測方法 | 光學(xué)多通道同步檢測 |
| 支持染料 | SYBR Green I,、TaqMan探針等 |
四,、工作原理
LightCycler® 96 的工作流程遵循標(biāo)準(zhǔn)的實時熒光PCR過程，其核心為：
模板擴(kuò)增：在熱循環(huán)條件下,，由特異性引物,、探針、酶等反應(yīng)組分合成目標(biāo)DNA,。
熒光監(jiān)測：熒光染料與擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合,，熒光強(qiáng)度隨著擴(kuò)增進(jìn)行而增強(qiáng)，系統(tǒng)實時記錄每個循環(huán)的熒光值,。
Ct值計算：軟件自動識別熒光信號達(dá)到閾值時的循環(huán)數(shù),，生成Ct（Cycle threshold）值。
定量分析：通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法或ΔΔCt法對未知樣品進(jìn)行相對或絕對定量,。
五,、關(guān)鍵特性與優(yōu)勢
1. 精準(zhǔn)的溫度控制
LightCycler® 96 的溫控模塊采用多點溫度傳感器和閉環(huán)控制算法，保障各孔間溫差控制在±0.2°C以內(nèi),。熱循環(huán)效率高,，縮短實驗總耗時。
2. 多通道熒光檢測系統(tǒng)
四個熒光通道可同步采集不同染料信號,，適合SYBR Green法和TaqMan探針法的單重或多重PCR實驗,。每個通道設(shè)有獨立激發(fā)與發(fā)射濾光片，避免通道間信號干擾,，提高檢測靈敏度和特異性,。
3. 軟件智能化分析
LightCycler® 96配套軟件界面簡潔直觀，提供圖形化編程與數(shù)據(jù)分析功能,，包括：
實時擴(kuò)增曲線,、熔解曲線圖
Ct值自動計算
標(biāo)準(zhǔn)曲線生成與效率評估
多重擴(kuò)增數(shù)據(jù)整合
此外,，軟件支持批量數(shù)據(jù)導(dǎo)出，便于后續(xù)統(tǒng)計分析與報告撰寫,。
4. 開放性實驗設(shè)置
支持用戶自定義擴(kuò)增程序與檢測方案,，適用于多種應(yīng)用需求?？蛇M(jìn)行末端熔解曲線分析,，用于鑒定引物特異性與判斷非特異擴(kuò)增產(chǎn)物,。
六,、典型應(yīng)用場景
1. 基因表達(dá)定量
通過反轉(zhuǎn)錄實時PCR（RT-qPCR）技術(shù)，研究目標(biāo)基因在不同處理組,、時間點或組織中的表達(dá)差異,。
2. 病原體檢測
快速檢測病毒、細(xì)菌,、真菌等病原體DNA/RNA,，包括新發(fā)傳染病的快速篩查（如新冠病毒、甲型流感等）,。
3. 基因多態(tài)性與突變分析
結(jié)合TaqMan探針或熔解曲線分析技術(shù),，識別單核苷酸多態(tài)性（SNP）與點突變。
4. 拷貝數(shù)變異分析
適用于腫瘤基因擴(kuò)增,、拷貝數(shù)異常分析,，輔助診斷與藥物靶點篩選。
七,、操作流程簡述
反應(yīng)體系配制：按實驗方案準(zhǔn)備引物,、探針、酶等反應(yīng)組分,，分裝于96孔板中,。
程序設(shè)置：在軟件中設(shè)定熱循環(huán)參數(shù)，包括初始變性,、退火,、延伸步驟及熒光采集通道。
加載樣品：將PCR板封膜后置于儀器托盤內(nèi),。
啟動實驗：點擊運行按鈕后,，系統(tǒng)自動執(zhí)行熱循環(huán)并采集實時熒光信號。
數(shù)據(jù)分析：實驗結(jié)束后,，使用軟件生成擴(kuò)增曲線,、計算Ct值、進(jìn)行定量分析或熔解曲線判斷,。
八,、儀器維護(hù)與注意事項
為確保設(shè)備長期穩(wěn)定運行,，應(yīng)定期進(jìn)行以下操作：
清潔光學(xué)模塊：用無塵布擦拭樣品托盤，避免熒光通道污染,。
校準(zhǔn)溫控系統(tǒng)：使用標(biāo)準(zhǔn)板驗證溫控均一性,，必要時進(jìn)行系統(tǒng)校準(zhǔn)。
軟件升級與備份：定期檢查軟件更新,，導(dǎo)出重要實驗數(shù)據(jù)防止丟失,。
防止冷凝水進(jìn)入儀器：實驗過程中避免樣品板冷凝水倒流。
九,、發(fā)展趨勢與展望
隨著分子診斷技術(shù)的發(fā)展,，實時PCR儀器正朝向多通道、高通量,、小型化與自動化方向演進(jìn),。LightCycler® 96 在提供可靠數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上，若結(jié)合自動加樣系統(tǒng),、生物信息分析平臺等,，將更好地滿足精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)、環(huán)境監(jiān)測,、食品安全等多場景應(yīng)用,。
十、結(jié)語
羅氏LightCycler® 96 實時熒光定量PCR儀以其穩(wěn)定的性能,、友好的軟件操作體驗以及多種兼容的實驗方案,，為分子生物學(xué)實驗提供了可靠的技術(shù)平臺。盡管在通量和自動化程度上尚有拓展空間,，但作為科研與教學(xué)實驗室的常規(guī)工具,，其表現(xiàn)足以支撐日常分析任務(wù)。未來,，結(jié)合上游核酸提取與下游數(shù)據(jù)解讀系統(tǒng)的整合,，qPCR平臺的智能化水平有望進(jìn)一步提升。
