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         [實驗目的]

通過本實驗,，掌握大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備及轉(zhuǎn)化的方法和技術(shù)

        [實驗原理]

        細菌處于容易吸收外源DNA 的狀態(tài)叫感受態(tài),。轉(zhuǎn)化是指質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組子導入細菌的過程。其原理是細菌處于0℃,，CaCl2低滲溶液中,，菌細胞膨脹成球形。轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸復合物粘附于細胞表面,，經(jīng)42℃短時間熱擊處理,，促進細胞吸收DNA復合物,。將細菌放置在非選擇性培養(yǎng)基中保溫一段時間，促使在轉(zhuǎn)化過程中獲得的新的表型（如Ampr等）得到表達,，然后將此細菌培養(yǎng)物涂在含有氨芐青霉素的選擇性培養(yǎng)基上,。

        [實驗儀器與設(shè)備]

1．超凈工作臺 2.低溫離心機

3. 恒溫搖床 4.電熱恒溫培養(yǎng)箱

5. -70℃ 6. 恒溫水浴器

        [實驗材料]

1.氯化鈣(CaCl2) 2.胰蛋白胨

3.酵母提取物 4.氯化鈉(NaCl)

5.氨芐青霉素 6.大腸桿菌DH5α

7.pUC19質(zhì)粒 8. 50ml離心管

9.吸頭、培養(yǎng)皿,、錐形瓶等

        附試劑的配制：

1. 0.1mol/L CaCl2溶液

2. LB液體培養(yǎng)基

配制每升培養(yǎng)基,，應在950ml去離子水中加入：

胰蛋白胨（bacto-typtone） 10g

酵母提取物（bacto-yeast extract） 5g

NaCl 10g

搖動容器直至溶質(zhì)*溶解，用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0,加入去離子水至總體積為1L,121℃濕熱滅菌20min,。

3．氨芐青霉素（Amp）,用無菌水配制成100mg/ml溶液,，置-20℃冰箱保存。

        [實驗步驟]

1．從大腸桿菌DH5α平板上挑取一個單菌落接于2ml LB液體培養(yǎng)基的試管中,，37℃振蕩培養(yǎng)過夜,。

2．取0.5 ml菌液轉(zhuǎn)接到一個含有50ml LB液體培養(yǎng)基錐形瓶中, 37℃振蕩培養(yǎng)2-3h.(此時,OD600<=0.5,細胞數(shù)務必<108/ ml,此為實驗成功的關(guān)鍵).

3.將菌液轉(zhuǎn)移到50 ml離心管中,冰上放置10min.

4.離心10min(4000rpm),回收細胞.

5.倒出培養(yǎng)液,將管倒置1min以便培養(yǎng)液流盡.

6.用冰冷的0.1mol/L CaCl210ml懸浮沉淀,立即放在冰上保溫30min。

7．0-4℃6000rpm,，離心10min,，回收細胞。

8．用冰冷的0.1mol/L CaCl22ml懸浮細胞 ,。（務心放冰上）

9．分裝細胞,，每200μl一份。此細胞為感受態(tài)細胞,。

10．取200μl新鮮配制的感受態(tài)細胞,，加入DNA 2μl（50ng）混勻，冰上放置30min,。

        同時做兩個對照管：

受體菌對照：200μl感受態(tài)細胞+2μl無菌水

質(zhì)粒對照：200μl 0.1mol/L CaCl2溶液+2μl質(zhì)粒DNA溶液

11．將管放到42℃循環(huán)水浴1-2min,。

12．冰浴2min.

13．每管加800μl LB液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)1h(慢搖),。

14．將適當體積已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細胞,，涂在含有氨芐青霉素的固體培養(yǎng)基上。

15．倒置平皿在電熱恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng)12-16h,，出現(xiàn)菌落,。

[實驗安排]

15學時

第1天下午—第2天上午：配LB培養(yǎng)基，接種,，液體培養(yǎng)

第2天上午,、下午：繼續(xù)培養(yǎng)2-3h,制備感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化,，培養(yǎng)12-16h

第3天上午：觀察結(jié)果