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牛奶中β-內(nèi)酰胺酶檢測方法

閱讀:2412        發(fā)布時間:2019/5/8
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        “無抗奶”,,顧名思義,,即不含抗生素的牛奶。早在2002年,,這一概念便被提出,,“無抗生素”的字樣也登上了乳品包裝。

        為何牛奶含抗生素?

        牛奶中的抗生素來自乳牛,,乳牛被注射抗生素,,主要是治療乳腺發(fā)炎。乳腺炎是奶牛常見病,,抗生素的使用是業(yè)內(nèi)“公開的秘密”,。牛奶中的抗生素可能導(dǎo)致飲用者過敏,或因長期接觸抗生素而耐藥,。

        如何做到“無抗”,?

        藥品合理間隔期后才擠奶,可以生產(chǎn)無抗奶,,可以通過檢驗抗生素的方式驗證,。

        1、間接法

        方法原理:利用β-內(nèi)酰胺酶能夠酶解青霉素的原理,,向牛奶中添加一定量的青霉素,,如果牛奶中存在一定濃度的β-內(nèi)酰胺酶,那么青霉素經(jīng)β-內(nèi)酰胺酶酶解后濃度會減少,,從而判斷牛奶中是否存在β-內(nèi)酰胺酶,。

        實驗步驟:稱取20 g試樣,在4℃,、16000rpm條件下離心10 min,。取下層清液10 g于50 mL塑料離心管,并將塑料離心管置于37℃水浴鍋中振蕩孵育30 min,。向孵育后的離心管中加入無水乙醇15 mL,。振蕩提取30 min后離心,將上層清液過濾紙后收集于梨形瓶中,。減壓濃縮蒸發(fā)掉乙醇,。向旋蒸后的梨形瓶中加入10 mL磷酸鹽緩沖液(pH=8.5),渦旋1 min后調(diào)節(jié)pH為8.5,。以1 mL/min的速度將提取液通過經(jīng)過預(yù)處理的Oasis HLB固相萃取柱,,用2 mL磷酸緩沖液(pH=8.5)淋洗萃取柱,再用2 mL水淋洗,。MAX后用3 mL乙腈洗脫,。將洗脫液在40℃下氮氣吹干,用0.025 M磷酸鹽緩沖液(pH=7.0)定容殘渣至1 mL,待上機測定,。

        色譜條件:LabAlliance PC-2000液相色譜配500型紫外檢測器,;

          lanbo色譜柱 :C18(4.6mm×150mm×5μm);

          流動相: 甲醇/0.004M 磷酸二氫鉀(pH=4.5)=40/60,;

          檢測波長: 268 nm

        2,、直接法

        方法原理:牛乳中的青霉素鉀在β-內(nèi)酰胺酶的作用下,,主要生成青霉噻唑酸鉀,并伴隨生成少量的青霉胺,、青霉醛等物質(zhì),。經(jīng)去脂肪、蛋白等前處理后,,可以將青霉噻唑酸鉀提取出來,,經(jīng)液相色譜儀檢測確認(rèn)其是否存在,從而判定該牛乳是否為人造“無抗奶”,。

        實驗步驟:稱取20 g試樣,,在4 ℃、16000 rpm條件下離心10 min,。取下層清液10 g于50 mL塑料離心管,,加入無水乙醇15 mL,振蕩提取30 min后離心,,取清液經(jīng)0.45 μm的濾膜過濾,,用液相色譜儀檢測。

        標(biāo)準(zhǔn)溶液配制:稱取0.01 g(至0.001 g)青霉素鉀于100 ml容量瓶中,,加入1ml市售抗生素分解劑,,室溫放置2h使青霉素鉀酶解*后用去離子水定容,得到青霉噻唑酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液,,濃度100 μg/mL。根據(jù)實際情況稀釋后使用,。

        色譜條件:LabAlliance PC-2000液相色譜配2000型紫外檢測器,;

         lanbo色譜柱 :C18(4.6mm×150mm×5μm);

          流動相: 甲醇/0.004 M磷酸二氫鉀(pH=4.5)=40/60,;

          檢測波長: 230 nm

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