人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞hCMEC/D3
培養(yǎng)說明書
一,、細(xì)胞培養(yǎng)條件
產(chǎn)品名稱 | 人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞 | 英文名稱 | hCMEC/D3 |
生長特性 | 貼壁生長 | 凍存條件 | 無血清凍存液(貨號:C7001) |
培養(yǎng)體系 | ECM培養(yǎng)基(瓶中為維持培養(yǎng)基,,收到細(xì)胞請及時更換培養(yǎng)基) | ||
傳代方法 | 第一次建議1:2傳代 | 傳代情況 | 2天換液 |
備注 | 1、消化后需用含10% FBS的培養(yǎng)基(DMEM+10%FBS或1640+10%FBS均可)終止消化并離心收集,。 2,、傳代需使用新的培養(yǎng)器皿(6cm皿或T25瓶) |
二、細(xì)胞收到后處理
細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)至良好狀態(tài)后灌滿培養(yǎng)液并封好瓶口是細(xì)胞運輸?shù)淖詈棉k法,。收到細(xì)胞回到自己的實驗室后,,先打開外包裝,,用75%酒精噴灑整個瓶消毒后放到超凈臺內(nèi),嚴(yán)格無菌操作,,培養(yǎng)箱靜置2-4小時,。鏡下觀察:未超過80%匯合度時,可將培養(yǎng)液收集至離心管中,,加入6ml培養(yǎng)基,,放入37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng),;超過80%匯合度時,,根據(jù)情況傳代或者凍存,具體操作見細(xì)胞培養(yǎng)步驟,。(注意發(fā)貨的是密封培養(yǎng)瓶的話,,放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)記得培養(yǎng)瓶蓋子擰松)
三、細(xì)胞培養(yǎng)步驟
1)復(fù)蘇細(xì)胞:將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍,,加入5mL培養(yǎng)基混合均勻,。在1000RPM條件下離心5分鐘,棄去上清液,,補加4-6mL培養(yǎng)基后吹勻,。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜(或?qū)⒓?xì)胞懸液加入6cm皿中),培養(yǎng)過夜,。第二天換液并檢查細(xì)胞密度,。
2)細(xì)胞傳代:如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%,即可進行傳代培養(yǎng),。
1,、對于貼壁細(xì)胞,傳代可參考以下方法:
1. 棄去培養(yǎng)上清,,用不含鈣,、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。
2. 加1-2ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培養(yǎng)瓶中,,置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min,,然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況,若細(xì)胞大部分變圓并脫落,,迅速拿回操作臺,,輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加5ml以上含10%血清的培養(yǎng)基終止消化。
3.輕輕吹打細(xì)胞,,脫落后吸出,,在1000RPM條件下離心8-10分鐘,棄去上清液,,補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻,。
4. 按5-6ml/瓶補加培養(yǎng)液,將細(xì)胞懸液按1:2的比例分到新的含5-6 ml培養(yǎng)液的新皿中或者瓶中,。
3)細(xì)胞凍存:
1,、細(xì)胞生長至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時,棄T25培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液,,用PBS清洗細(xì)胞一次,;
2、添加0.25%胰蛋白酶消化液約1ml至培養(yǎng)瓶中,,倒置顯微鏡下觀察,,待細(xì)胞回縮變圓后加入5ml培養(yǎng)液終止消化,再輕輕吹打細(xì)胞使之脫落,,然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中,,1000rpm離心 5min;
3,、 棄上清,,沉淀細(xì)胞加入1ml的雅吉生物無血清凍存液(貨號:C7001),混勻后加入凍存管中,。
4,、 將凍存細(xì)胞直接放入-80℃冰箱即可,如后期要將細(xì)胞轉(zhuǎn)入液氮罐中,,則需在-80℃冰箱 中存放24小時以上再轉(zhuǎn)入液氮罐中,。
四、售后服務(wù)告知書
1)細(xì)胞出現(xiàn)問題,,可重發(fā)的情況有哪些,?判定標(biāo)準(zhǔn)是什么?
1. 細(xì)胞運輸途中遭遇的各種問題,,細(xì)胞丟失,、瓶身破損、培養(yǎng)液嚴(yán)重漏液等,,重發(fā),;
2. 細(xì)胞污染問題,請在收到產(chǎn)品48小時內(nèi),,給我們提出真實的實驗結(jié)果,,核實后重發(fā);
3. 常溫發(fā)貨的細(xì)胞靜置24小時后,,干冰凍存發(fā)貨的細(xì)胞復(fù)蘇后24小時后,,絕大多數(shù)細(xì)胞未存活,(需提供真實清晰的細(xì)胞狀態(tài)照片),,重發(fā),;
4. 干冰凍存發(fā)貨的細(xì)胞復(fù)蘇后24小時后或常溫發(fā)貨的細(xì)胞靜置4小時候并且未開封,,出現(xiàn)污染,重發(fā),;
5. 細(xì)胞活性問題,,請在收到產(chǎn)品7天內(nèi)給我們提出真實的實驗結(jié)果,用臺盼藍(lán)染色法鑒定細(xì)胞活力,,核實后予重發(fā),;
6. 細(xì)胞收到當(dāng)天以及第2,3天請拍照,3天未告知的,,視為產(chǎn)品合格,。4-7天內(nèi)出現(xiàn)問題有提供收到細(xì)胞前3天照片和細(xì)胞出現(xiàn)問題時照片以及細(xì)胞相關(guān)操作的詳細(xì)步驟的,并跟技術(shù)人員溝通的,,由技術(shù)人員判定為我方責(zé)任的,,重發(fā)。技術(shù)人員判定為雙方承擔(dān)責(zé)任的由雙方進行協(xié)商處理或者按合同價的50%收費重發(fā),。
二)細(xì)胞出現(xiàn)問題,,不予以重發(fā)的情況有哪些?
1. 客戶造成細(xì)胞污染,,不重發(fā),;
2. 客戶不正確操作致細(xì)胞狀態(tài)不好,不重發(fā),;
3. 非本庫推薦細(xì)胞培養(yǎng)體系致的細(xì)胞狀態(tài)不好,,不重發(fā);
4. 細(xì)胞狀態(tài)不好,,未提供細(xì)胞培養(yǎng)前3天照片的,,不重發(fā);
5. 細(xì)胞培養(yǎng)時經(jīng)其它處理的,,不重發(fā),;
6. 細(xì)胞收到2天內(nèi),未告知,,不重發(fā),;
7. 視具體情況而定。
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