人腦微血管內(nèi)皮細胞hCMEC/D3
培養(yǎng)說明書
一、細胞培養(yǎng)條件
產(chǎn)品名稱 | 人腦微血管內(nèi)皮細胞 | 英文名稱 | hCMEC/D3 |
生長特性 | 貼壁生長 | 凍存條件 | 無血清凍存液（貨號：C7001） |
培養(yǎng)體系 | ECM培養(yǎng)基（瓶中為維持培養(yǎng)基,，收到細胞請及時更換培養(yǎng)基） | ||
傳代方法 | 第一次建議1:2傳代 | 傳代情況 | 2天換液 |
備注 | 1,、消化后需用含10% FBS的培養(yǎng)基（DMEM+10%FBS或1640+10%FBS均可）終止消化并離心收集。 2,、傳代需使用新的培養(yǎng)器皿（6cm皿或T25瓶） | ||
二,、細胞收到后處理
細胞在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)至良好狀態(tài)后灌滿培養(yǎng)液并封好瓶口是細胞運輸?shù)淖詈棉k法。收到細胞回到自己的實驗室后,，先打開外包裝,，用75%酒精噴灑整個瓶消毒后放到超凈臺內(nèi)，嚴格無菌操作,，培養(yǎng)箱靜置2-4小時,。鏡下觀察：未超過80%匯合度時,，可將培養(yǎng)液收集至離心管中，加入6ml培養(yǎng)基,，放入37℃,、5%CO2孵箱培養(yǎng)；超過80%匯合度時,，根據(jù)情況傳代或者凍存,，具體操作見細胞培養(yǎng)步驟。（注意發(fā)貨的是密封培養(yǎng)瓶的話,，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)記得培養(yǎng)瓶蓋子擰松）
三,、細胞培養(yǎng)步驟
1）復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入5mL培養(yǎng)基混合均勻,。在1000RPM條件下離心5分鐘,，棄去上清液，補加4-6mL培養(yǎng)基后吹勻,。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓毎麘乙杭尤?cm皿中）,，培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細胞密度,。
2）細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%,，即可進行傳代培養(yǎng)。
1,、對于貼壁細胞,，傳代可參考以下方法：
1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣,、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次,。
2. 加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min,，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況,，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺,，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加5ml以上含10%血清的培養(yǎng)基終止消化,。
3.輕輕吹打細胞，脫落后吸出,，在1000RPM條件下離心8-10分鐘,，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻,。
4. 按5-6ml/瓶補加培養(yǎng)液,，將細胞懸液按1：2的比例分到新的含5-6 ml培養(yǎng)液的新皿中或者瓶中。
3）細胞凍存：
1,、細胞生長至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時,，棄T25培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液,，用PBS清洗細胞一次；
2,、添加0.25%胰蛋白酶消化液約1ml至培養(yǎng)瓶中,，倒置顯微鏡下觀察，待細胞回縮變圓后加入5ml培養(yǎng)液終止消化,，再輕輕吹打細胞使之脫落，然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中,，1000rpm離心 5min,；
3、 棄上清,，沉淀細胞加入1ml的雅吉生物無血清凍存液（貨號：C7001）,，混勻后加入凍存管中。
4,、 將凍存細胞直接放入-80℃冰箱即可,，如后期要將細胞轉(zhuǎn)入液氮罐中，則需在-80℃冰箱 中存放24小時以上再轉(zhuǎn)入液氮罐中,。
四,、售后服務告知書
1）細胞出現(xiàn)問題，可重發(fā)的情況有哪些,？判定標準是什么,？
1. 細胞運輸途中遭遇的各種問題，細胞丟失,、瓶身破損,、培養(yǎng)液嚴重漏液等，重發(fā),；
2. 細胞污染問題,，請在收到產(chǎn)品48小時內(nèi)，給我們提出真實的實驗結(jié)果,，核實后重發(fā),；
3. 常溫發(fā)貨的細胞靜置24小時后，干冰凍存發(fā)貨的細胞復蘇后24小時后,，絕大多數(shù)細胞未存活,，（需提供真實清晰的細胞狀態(tài)照片），重發(fā),；
4. 干冰凍存發(fā)貨的細胞復蘇后24小時后或常溫發(fā)貨的細胞靜置4小時候并且未開封,，出現(xiàn)污染，重發(fā),；
5. 細胞活性問題,，請在收到產(chǎn)品7天內(nèi)給我們提出真實的實驗結(jié)果,，用臺盼藍染色法鑒定細胞活力，核實后予重發(fā),；
6. 細胞收到當天以及第2,3天請拍照,，3天未告知的，視為產(chǎn)品合格,。4-7天內(nèi)出現(xiàn)問題有提供收到細胞前3天照片和細胞出現(xiàn)問題時照片以及細胞相關操作的詳細步驟的,，并跟技術人員溝通的，由技術人員判定為我方責任的,，重發(fā),。技術人員判定為雙方承擔責任的由雙方進行協(xié)商處理或者按合同價的50%收費重發(fā)。
二）細胞出現(xiàn)問題,，不予以重發(fā)的情況有哪些,？
1. 客戶造成細胞污染，不重發(fā),；
2. 客戶不正確操作致細胞狀態(tài)不好,，不重發(fā)；
3. 非本庫推薦細胞培養(yǎng)體系致的細胞狀態(tài)不好,，不重發(fā),；
4. 細胞狀態(tài)不好，未提供細胞培養(yǎng)前3天照片的,，不重發(fā),；
5. 細胞培養(yǎng)時經(jīng)其它處理的，不重發(fā),；
6. 細胞收到2天內(nèi),，未告知，不重發(fā),；
7. 視具體情況而定,。
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