人腦微血管內(nèi)皮細胞hCMEC/D3
培養(yǎng)說明書
一,、細胞培養(yǎng)條件
產(chǎn)品名稱 | 人腦微血管內(nèi)皮細胞 | 英文名稱 | hCMEC/D3 |
生長特性 | 貼壁生長 | 凍存條件 | 無血清凍存液(貨號:C7001) |
培養(yǎng)體系 | ECM培養(yǎng)基(瓶中為維持培養(yǎng)基,收到細胞請及時更換培養(yǎng)基) | ||
傳代方法 | 第一次建議1:2傳代 | 傳代情況 | 2天換液 |
備注 | 1,、消化后需用含10% FBS的培養(yǎng)基(DMEM+10%FBS或1640+10%FBS均可)終止消化并離心收集,。 2、傳代需使用新的培養(yǎng)器皿(6cm皿或T25瓶) |
二,、細胞收到后處理
細胞在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)至良好狀態(tài)后灌滿培養(yǎng)液并封好瓶口是細胞運輸?shù)淖詈棉k法,。收到細胞回到自己的實驗室后,先打開外包裝,,用75%酒精噴灑整個瓶消毒后放到超凈臺內(nèi),,嚴(yán)格無菌操作,,培養(yǎng)箱靜置2-4小時。鏡下觀察:未超過80%匯合度時,,可將培養(yǎng)液收集至離心管中,,加入6ml培養(yǎng)基,放入37℃,、5%CO2孵箱培養(yǎng),;超過80%匯合度時,根據(jù)情況傳代或者凍存,,具體操作見細胞培養(yǎng)步驟,。(注意發(fā)貨的是密封培養(yǎng)瓶的話,放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)記得培養(yǎng)瓶蓋子擰松)
三,、細胞培養(yǎng)步驟
1)復(fù)蘇細胞:將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍,,加入5mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心5分鐘,,棄去上清液,,補加4-6mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜(或?qū)⒓毎麘乙杭尤?cm皿中),,培養(yǎng)過夜,。第二天換液并檢查細胞密度。
2)細胞傳代:如果細胞密度達80%-90%,,即可進行傳代培養(yǎng),。
1、對于貼壁細胞,,傳代可參考以下方法:
1. 棄去培養(yǎng)上清,,用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次,。
2. 加1-2ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培養(yǎng)瓶中,,置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min,然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況,,若細胞大部分變圓并脫落,,迅速拿回操作臺,輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加5ml以上含10%血清的培養(yǎng)基終止消化,。
3.輕輕吹打細胞,,脫落后吸出,,在1000RPM條件下離心8-10分鐘,,棄去上清液,補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻,。
4. 按5-6ml/瓶補加培養(yǎng)液,,將細胞懸液按1:2的比例分到新的含5-6 ml培養(yǎng)液的新皿中或者瓶中,。
3)細胞凍存:
1、細胞生長至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時,,棄T25培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液,,用PBS清洗細胞一次;
2,、添加0.25%胰蛋白酶消化液約1ml至培養(yǎng)瓶中,,倒置顯微鏡下觀察,待細胞回縮變圓后加入5ml培養(yǎng)液終止消化,,再輕輕吹打細胞使之脫落,,然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中,1000rpm離心 5min,;
3,、 棄上清,沉淀細胞加入1ml的雅吉生物無血清凍存液(貨號:C7001),,混勻后加入凍存管中,。
4、 將凍存細胞直接放入-80℃冰箱即可,,如后期要將細胞轉(zhuǎn)入液氮罐中,,則需在-80℃冰箱 中存放24小時以上再轉(zhuǎn)入液氮罐中。
四,、售后服務(wù)告知書
1)細胞出現(xiàn)問題,,可重發(fā)的情況有哪些?判定標(biāo)準(zhǔn)是什么,?
1. 細胞運輸途中遭遇的各種問題,,細胞丟失、瓶身破損,、培養(yǎng)液嚴(yán)重漏液等,,重發(fā);
2. 細胞污染問題,,請在收到產(chǎn)品48小時內(nèi),,給我們提出真實的實驗結(jié)果,核實后重發(fā),;
3. 常溫發(fā)貨的細胞靜置24小時后,,干冰凍存發(fā)貨的細胞復(fù)蘇后24小時后,絕大多數(shù)細胞未存活,,(需提供真實清晰的細胞狀態(tài)照片),,重發(fā);
4. 干冰凍存發(fā)貨的細胞復(fù)蘇后24小時后或常溫發(fā)貨的細胞靜置4小時候并且未開封,,出現(xiàn)污染,,重發(fā),;
5. 細胞活性問題,請在收到產(chǎn)品7天內(nèi)給我們提出真實的實驗結(jié)果,,用臺盼藍染色法鑒定細胞活力,,核實后予重發(fā);
6. 細胞收到當(dāng)天以及第2,3天請拍照,,3天未告知的,,視為產(chǎn)品合格。4-7天內(nèi)出現(xiàn)問題有提供收到細胞前3天照片和細胞出現(xiàn)問題時照片以及細胞相關(guān)操作的詳細步驟的,,并跟技術(shù)人員溝通的,,由技術(shù)人員判定為我方責(zé)任的,重發(fā),。技術(shù)人員判定為雙方承擔(dān)責(zé)任的由雙方進行協(xié)商處理或者按合同價的50%收費重發(fā),。
二)細胞出現(xiàn)問題,不予以重發(fā)的情況有哪些,?
1. 客戶造成細胞污染,,不重發(fā);
2. 客戶不正確操作致細胞狀態(tài)不好,,不重發(fā),;
3. 非本庫推薦細胞培養(yǎng)體系致的細胞狀態(tài)不好,不重發(fā),;
4. 細胞狀態(tài)不好,,未提供細胞培養(yǎng)前3天照片的,不重發(fā),;
5. 細胞培養(yǎng)時經(jīng)其它處理的,,不重發(fā);
6. 細胞收到2天內(nèi),,未告知,,不重發(fā);
7. 視具體情況而定,。
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