人腦微血管內(nèi)皮細胞hCMEC/D3
培養(yǎng)說明書
一,、細胞培養(yǎng)條件
產(chǎn)品名稱 | 人腦微血管內(nèi)皮細胞 | 英文名稱 | hCMEC/D3 |
生長特性 | 貼壁生長 | 凍存條件 | 無血清凍存液（貨號：C7001） |
培養(yǎng)體系 | ECM培養(yǎng)基（瓶中為維持培養(yǎng)基，收到細胞請及時更換培養(yǎng)基） | ||
傳代方法 | 第一次建議1:2傳代 | 傳代情況 | 2天換液 |
備注 | 1,、消化后需用含10% FBS的培養(yǎng)基（DMEM+10%FBS或1640+10%FBS均可）終止消化并離心收集,。 2、傳代需使用新的培養(yǎng)器皿（6cm皿或T25瓶） | ||
二,、細胞收到后處理
細胞在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)至良好狀態(tài)后灌滿培養(yǎng)液并封好瓶口是細胞運輸?shù)淖詈棉k法,。收到細胞回到自己的實驗室后，先打開外包裝,，用75%酒精噴灑整個瓶消毒后放到超凈臺內(nèi),，嚴(yán)格無菌操作,，培養(yǎng)箱靜置2-4小時。鏡下觀察：未超過80%匯合度時,，可將培養(yǎng)液收集至離心管中,，加入6ml培養(yǎng)基，放入37℃,、5%CO2孵箱培養(yǎng),；超過80%匯合度時，根據(jù)情況傳代或者凍存,，具體操作見細胞培養(yǎng)步驟,。（注意發(fā)貨的是密封培養(yǎng)瓶的話，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)記得培養(yǎng)瓶蓋子擰松）
三,、細胞培養(yǎng)步驟
1）復(fù)蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍,，加入5mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心5分鐘,，棄去上清液,，補加4-6mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓毎麘乙杭尤?cm皿中）,，培養(yǎng)過夜,。第二天換液并檢查細胞密度。
2）細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%,，即可進行傳代培養(yǎng),。
1、對于貼壁細胞,，傳代可參考以下方法：
1. 棄去培養(yǎng)上清,，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次,。
2. 加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中,，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況,，若細胞大部分變圓并脫落,，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加5ml以上含10%血清的培養(yǎng)基終止消化,。
3.輕輕吹打細胞,，脫落后吸出,，在1000RPM條件下離心8-10分鐘,，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻,。
4. 按5-6ml/瓶補加培養(yǎng)液,，將細胞懸液按1：2的比例分到新的含5-6 ml培養(yǎng)液的新皿中或者瓶中,。
3）細胞凍存：
1、細胞生長至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時,，棄T25培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液,，用PBS清洗細胞一次；
2,、添加0.25%胰蛋白酶消化液約1ml至培養(yǎng)瓶中,，倒置顯微鏡下觀察，待細胞回縮變圓后加入5ml培養(yǎng)液終止消化,，再輕輕吹打細胞使之脫落,，然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，1000rpm離心 5min,；
3,、 棄上清，沉淀細胞加入1ml的雅吉生物無血清凍存液（貨號：C7001）,，混勻后加入凍存管中,。
4、 將凍存細胞直接放入-80℃冰箱即可,，如后期要將細胞轉(zhuǎn)入液氮罐中,，則需在-80℃冰箱 中存放24小時以上再轉(zhuǎn)入液氮罐中。
四,、售后服務(wù)告知書
1）細胞出現(xiàn)問題,，可重發(fā)的情況有哪些？判定標(biāo)準(zhǔn)是什么,？
1. 細胞運輸途中遭遇的各種問題,，細胞丟失、瓶身破損,、培養(yǎng)液嚴(yán)重漏液等,，重發(fā)；
2. 細胞污染問題,，請在收到產(chǎn)品48小時內(nèi),，給我們提出真實的實驗結(jié)果，核實后重發(fā),；
3. 常溫發(fā)貨的細胞靜置24小時后,，干冰凍存發(fā)貨的細胞復(fù)蘇后24小時后，絕大多數(shù)細胞未存活,，（需提供真實清晰的細胞狀態(tài)照片）,，重發(fā)；
4. 干冰凍存發(fā)貨的細胞復(fù)蘇后24小時后或常溫發(fā)貨的細胞靜置4小時候并且未開封,，出現(xiàn)污染,，重發(fā),；
5. 細胞活性問題，請在收到產(chǎn)品7天內(nèi)給我們提出真實的實驗結(jié)果,，用臺盼藍染色法鑒定細胞活力,，核實后予重發(fā)；
6. 細胞收到當(dāng)天以及第2,3天請拍照,，3天未告知的,，視為產(chǎn)品合格。4-7天內(nèi)出現(xiàn)問題有提供收到細胞前3天照片和細胞出現(xiàn)問題時照片以及細胞相關(guān)操作的詳細步驟的,，并跟技術(shù)人員溝通的,，由技術(shù)人員判定為我方責(zé)任的，重發(fā),。技術(shù)人員判定為雙方承擔(dān)責(zé)任的由雙方進行協(xié)商處理或者按合同價的50%收費重發(fā),。
二）細胞出現(xiàn)問題，不予以重發(fā)的情況有哪些,？
1. 客戶造成細胞污染,，不重發(fā)；
2. 客戶不正確操作致細胞狀態(tài)不好,，不重發(fā),；
3. 非本庫推薦細胞培養(yǎng)體系致的細胞狀態(tài)不好，不重發(fā),；
4. 細胞狀態(tài)不好,，未提供細胞培養(yǎng)前3天照片的，不重發(fā),；
5. 細胞培養(yǎng)時經(jīng)其它處理的,，不重發(fā)；
6. 細胞收到2天內(nèi),，未告知,，不重發(fā)；
7. 視具體情況而定,。
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