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人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞hCMEC/D3

培養(yǎng)說(shuō)明書

一、細(xì)胞培養(yǎng)條件

二、細(xì)胞收到后處理

細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)至良好狀態(tài)后灌滿培養(yǎng)液并封好瓶口是細(xì)胞運(yùn)輸?shù)淖詈棉k法,。收到細(xì)胞回到自己的實(shí)驗(yàn)室后,，先打開外包裝，用75%酒精噴灑整個(gè)瓶消毒后放到超凈臺(tái)內(nèi),，嚴(yán)格無(wú)菌操作,，培養(yǎng)箱靜置2-4小時(shí)。鏡下觀察：未超過(guò)80%匯合度時(shí),，可將培養(yǎng)液收集至離心管中,，加入6ml培養(yǎng)基，放入37℃,、5%CO2孵箱培養(yǎng),；超過(guò)80%匯合度時(shí)，根據(jù)情況傳代或者凍存,，具體操作見(jiàn)細(xì)胞培養(yǎng)步驟,。（注意發(fā)貨的是密封培養(yǎng)瓶的話，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)記得培養(yǎng)瓶蓋子擰松）

三,、細(xì)胞培養(yǎng)步驟

1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍,，加入5mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心5分鐘,，棄去上清液,，補(bǔ)加4-6mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入6cm皿中）,，培養(yǎng)過(guò)夜,。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%,，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng),。

1、對(duì)于貼壁細(xì)胞，傳代可參考以下方法：

1. 棄去培養(yǎng)上清,，用不含鈣,、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。

2. 加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中,，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min,，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落,，迅速拿回操作臺(tái),，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加5ml以上含10%血清的培養(yǎng)基終止消化。

3.輕輕吹打細(xì)胞,，脫落后吸出,，在1000RPM條件下離心8-10分鐘，棄去上清液,，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻,。

4. 按5-6ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)液，將細(xì)胞懸液按1：2的比例分到新的含5-6 ml培養(yǎng)液的新皿中或者瓶中,。

3）細(xì)胞凍存：

1,、細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時(shí)，棄T25培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液,，用PBS清洗細(xì)胞一次,；

2、添加0.25%胰蛋白酶消化液約1ml至培養(yǎng)瓶中,，倒置顯微鏡下觀察,，待細(xì)胞回縮變圓后加入5ml培養(yǎng)液終止消化，再輕輕吹打細(xì)胞使之脫落,，然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中,，1000rpm離心 5min；

3,、 棄上清,，沉淀細(xì)胞加入1ml的雅吉生物無(wú)血清凍存液（貨號(hào)：C7001），混勻后加入凍存管中,。

4,、 將凍存細(xì)胞直接放入-80℃冰箱即可，如后期要將細(xì)胞轉(zhuǎn)入液氮罐中,，則需在-80℃冰箱 中存放24小時(shí)以上再轉(zhuǎn)入液氮罐中,。

四、售后服務(wù)告知書

1）細(xì)胞出現(xiàn)問(wèn)題,，可重發(fā)的情況有哪些,？判定標(biāo)準(zhǔn)是什么,？

1. 細(xì)胞運(yùn)輸途中遭遇的各種問(wèn)題，細(xì)胞丟失,、瓶身破損,、培養(yǎng)液嚴(yán)重漏液等，重發(fā),；

2. 細(xì)胞污染問(wèn)題,，請(qǐng)?jiān)谑盏疆a(chǎn)品48小時(shí)內(nèi)，給我們提出真實(shí)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,，核實(shí)后重發(fā),；

3. 常溫發(fā)貨的細(xì)胞靜置24小時(shí)后，干冰凍存發(fā)貨的細(xì)胞復(fù)蘇后24小時(shí)后,，絕大多數(shù)細(xì)胞未存活,，（需提供真實(shí)清晰的細(xì)胞狀態(tài)照片），重發(fā),；

4. 干冰凍存發(fā)貨的細(xì)胞復(fù)蘇后24小時(shí)后或常溫發(fā)貨的細(xì)胞靜置4小時(shí)候并且未開封,，出現(xiàn)污染，重發(fā),；

5. 細(xì)胞活性問(wèn)題，請(qǐng)?jiān)谑盏疆a(chǎn)品7天內(nèi)給我們提出真實(shí)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,，用臺(tái)盼藍(lán)染色法鑒定細(xì)胞活力,，核實(shí)后予重發(fā)；

6. 細(xì)胞收到當(dāng)天以及第2,3天請(qǐng)拍照,，3天未告知的,，視為產(chǎn)品合格。4-7天內(nèi)出現(xiàn)問(wèn)題有提供收到細(xì)胞前3天照片和細(xì)胞出現(xiàn)問(wèn)題時(shí)照片以及細(xì)胞相關(guān)操作的詳細(xì)步驟的,，并跟技術(shù)人員溝通的,，由技術(shù)人員判定為我方責(zé)任的，重發(fā),。技術(shù)人員判定為雙方承擔(dān)責(zé)任的由雙方進(jìn)行協(xié)商處理或者按合同價(jià)的50%收費(fèi)重發(fā),。

二）細(xì)胞出現(xiàn)問(wèn)題，不予以重發(fā)的情況有哪些,？

1. 客戶造成細(xì)胞污染,，不重發(fā)；

2. 客戶不正確操作致細(xì)胞狀態(tài)不好,，不重發(fā),；

3. 非本庫(kù)推薦細(xì)胞培養(yǎng)體系致的細(xì)胞狀態(tài)不好，不重發(fā),；

4. 細(xì)胞狀態(tài)不好,，未提供細(xì)胞培養(yǎng)前3天照片的,，不重發(fā)；

5. 細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)經(jīng)其它處理的,，不重發(fā),；

6. 細(xì)胞收到2天內(nèi)，未告知,，不重發(fā),；

7. 視具體情況而定。