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CCK-8試劑盒是一種基于WST-8的試劑盒,，用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的快速,、高靈敏度檢測(cè)等，具有使用方便,，檢測(cè)快速,，靈敏度高，重復(fù)性優(yōu)于MTT法,，毒性小,，適合于高通量藥物篩選等大規(guī)模實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的優(yōu)點(diǎn)。以下是使用CCK-8試劑盒進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測(cè)的步驟：

一,、細(xì)胞增殖分析

1.培養(yǎng)細(xì)胞并將其接種到96孔板中,。

2.在37℃、5% CO2,、90%濕度條件下培養(yǎng)24小時(shí),。

3.配制不同濃度梯度的樣本溶液，如300、100,、33.3,、11.1、3.7,、1.2,、0.4、0.14uM,。

4.每個(gè)濃度三個(gè)復(fù)孔加入到96孔板中,，在37℃、5% CO2,、90%濕度條件下培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間長(zhǎng)度,。如6，12,，24或48小時(shí),。

5.在CCK-8試劑盒中加入10μL的CCK-8溶液。

6.在37℃,、5% CO2,、90%濕度條件下培養(yǎng)0.5-4小時(shí)。

7.用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)量吸光度,。

8.用Excel及Graphpad Prism處理并分析結(jié)果,。

二、細(xì)胞毒性分析

1. 制備細(xì)胞懸液：細(xì)胞計(jì)數(shù)

2. 接種到96孔板中：根據(jù)合適的鋪板細(xì)胞數(shù),，每孔約100ul細(xì)胞懸液,，同樣的樣本可做3個(gè)重復(fù)。

3. 37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)：細(xì)胞接種后貼壁大約需要培養(yǎng)2-4小時(shí),，如果不需要貼壁,，這步可以省去。

4. 加入不同濃度的毒性物質(zhì)

5. 37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)：加入毒性物質(zhì)的培養(yǎng)時(shí)間,，要看毒性物質(zhì)的性質(zhì)和細(xì)胞的敏感性,，一般要根據(jù)細(xì)胞周期來決定，起碼要一代以上的時(shí)間,。

6. 加入10ulCCK8：由于每孔加入CCK8量比較少,，有可能因試劑沾在孔壁上而帶來誤差，建議在加完試劑后輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻,。

7. 培養(yǎng)1-4小時(shí):細(xì)胞種類不同,，形成的Formazan的量也不一樣。如果顯色不夠的話,，可以繼續(xù)培養(yǎng),，以確認(rèn)最佳條件,。特別是血液細(xì)胞形成的Formazan很少,，需要較長(zhǎng)的顯色時(shí)間（5-6小時(shí)）,。

8. 測(cè)定450nm吸光度：建議采用雙波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)波長(zhǎng)450-490nm,，參比波長(zhǎng)600-650nm,。

本期內(nèi)容：CCK-8試劑盒進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測(cè)的步驟是怎樣的？

下期內(nèi)容：直擴(kuò)pcr技術(shù)的使用場(chǎng)景及常見問題