酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定ELISA實(shí)驗(yàn)類(lèi)型有哪些,?有三種必需的試劑:已知的抗原或抗體(用于結(jié)合到固相載體上);酶標(biāo)的抗體或抗原(標(biāo)記物),;顯色劑(用于顯色),。
常見(jiàn)的ELISA實(shí)驗(yàn)有四種:直接ELISA,、間接ELISA,、夾心ELISA和競(jìng)爭(zhēng)ELISA。
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直接ELISA (Direct ELISA)
直接ELISA法是將樣品中的抗原或抗體以非特異性方式直接吸附在包被板上,,然后將特異性測(cè)定抗體或抗原加入到孔中,,洗滌后加入底物顯色。相較于其它類(lèi)型的ELISA實(shí)驗(yàn),,直接ELISA實(shí)驗(yàn)步驟少,,檢測(cè)速度快,不需要用到二抗,,避免了交叉反應(yīng),,測(cè)定結(jié)果不容易出錯(cuò)。但是由于直接ELISA的抗原不是特異性固定的,,樣本中的所有蛋白質(zhì)(靶蛋白及其他雜質(zhì)蛋白)都會(huì)與ELISA板結(jié)合,,實(shí)驗(yàn)背景會(huì)比較高。而且直接ELISA每種靶蛋白都需要準(zhǔn)備能夠與其特異性結(jié)合的一抗,實(shí)驗(yàn)不太靈活,。另外由于沒(méi)有使用二抗,,信號(hào)沒(méi)有被放大,降低了測(cè)定的靈敏度,。一般對(duì)抗原的免疫反應(yīng)進(jìn)行分析時(shí),,常會(huì)使用直接ELISA。
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間接ELISA (Indirect ELISA)
間接ELISA法主要用于抗體的檢測(cè),,先將抗原結(jié)合到ELISA板上,,隨后分兩步進(jìn)行檢測(cè):首先加入檢測(cè)抗體與抗原特異性結(jié)合,隨后加入酶標(biāo)二抗檢測(cè)并利用底物顯色,。與直接ELISA相比,,間接ELISA用到酶標(biāo)二抗,具有更高的靈敏度,,也需要更少的標(biāo)記抗體,,更經(jīng)濟(jì)。間接ELISA還提供了更大的靈活性,,因?yàn)椴煌囊豢鼓軌蚺c單一標(biāo)記的二抗一同使用,。間接ELISA實(shí)驗(yàn)的缺點(diǎn)是存在交叉反應(yīng)的可能性(酶標(biāo)二抗直接與抗原結(jié)合),可能會(huì)增加背景,,同時(shí)與直接ELISA相比,,間接ELISA實(shí)驗(yàn)多了二抗孵育的步驟,實(shí)驗(yàn)周期增長(zhǎng),。間接ELISA法適合測(cè)定樣品中總抗體的濃度,。
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夾心ELISA (Sandwich ELISA)
夾心ELISA實(shí)驗(yàn)需要用到配對(duì)抗體(捕獲抗體和檢測(cè)抗體),其實(shí)驗(yàn)原理是將捕獲抗體結(jié)合到ELISA板上,,通過(guò)捕獲抗體固定抗原,,隨后通過(guò)直接ELISA或間接ELISA的方式進(jìn)行檢測(cè)。在夾心ELISA實(shí)驗(yàn)中,,最重要的是對(duì)配對(duì)抗體進(jìn)行驗(yàn)證,,確保配對(duì)抗體能同時(shí)與抗原結(jié)合,以確保實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行,。
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競(jìng)爭(zhēng)ELISA (Competition ELISA)
競(jìng)爭(zhēng)ELISA,,先將特異性抗體包被于固相載體表面,經(jīng)洗滌后分成兩組:一組加酶標(biāo)記抗原和被測(cè)抗原的混合液,,另一組只加酶標(biāo)記抗原,,經(jīng)孵育洗滌后加底物顯色,這兩組底物降解量之差,,即為所要測(cè)定的未知抗原的量,。此方法測(cè)定的抗原只要有一個(gè)結(jié)合部位即可,對(duì)小分子抗原如激素和藥物類(lèi)的測(cè)定常用此法。優(yōu)點(diǎn)是快,,缺點(diǎn)是需要較多量的酶標(biāo)記抗原,。在競(jìng)爭(zhēng)ELISA實(shí)驗(yàn)中,樣品中的抗原或抗體競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合特定數(shù)量的酶標(biāo)抗體或抗原,。樣品中抗原濃度越高,,輸出信號(hào)越弱,信號(hào)輸出與樣品中抗原的量成反比,。
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