酶聯(lián)免疫吸附測定ELISA實驗類型有哪些,?有三種必需的試劑:已知的抗原或抗體(用于結(jié)合到固相載體上),;酶標的抗體或抗原(標記物);顯色劑(用于顯色),。
常見的ELISA實驗有四種:直接ELISA,、間接ELISA、夾心ELISA和競爭ELISA,。
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直接ELISA (Direct ELISA)
直接ELISA法是將樣品中的抗原或抗體以非特異性方式直接吸附在包被板上,,然后將特異性測定抗體或抗原加入到孔中,,洗滌后加入底物顯色。相較于其它類型的ELISA實驗,,直接ELISA實驗步驟少,,檢測速度快,不需要用到二抗,,避免了交叉反應(yīng),,測定結(jié)果不容易出錯。但是由于直接ELISA的抗原不是特異性固定的,,樣本中的所有蛋白質(zhì)(靶蛋白及其他雜質(zhì)蛋白)都會與ELISA板結(jié)合,實驗背景會比較高,。而且直接ELISA每種靶蛋白都需要準備能夠與其特異性結(jié)合的一抗,,實驗不太靈活。另外由于沒有使用二抗,,信號沒有被放大,,降低了測定的靈敏度。一般對抗原的免疫反應(yīng)進行分析時,,常會使用直接ELISA,。
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間接ELISA (Indirect ELISA)
間接ELISA法主要用于抗體的檢測,先將抗原結(jié)合到ELISA板上,,隨后分兩步進行檢測:首先加入檢測抗體與抗原特異性結(jié)合,,隨后加入酶標二抗檢測并利用底物顯色。與直接ELISA相比,,間接ELISA用到酶標二抗,,具有更高的靈敏度,也需要更少的標記抗體,,更經(jīng)濟,。間接ELISA還提供了更大的靈活性,因為不同的一抗能夠與單一標記的二抗一同使用,。間接ELISA實驗的缺點是存在交叉反應(yīng)的可能性(酶標二抗直接與抗原結(jié)合),,可能會增加背景,同時與直接ELISA相比,,間接ELISA實驗多了二抗孵育的步驟,,實驗周期增長。間接ELISA法適合測定樣品中總抗體的濃度,。
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夾心ELISA (Sandwich ELISA)
夾心ELISA實驗需要用到配對抗體(捕獲抗體和檢測抗體),,其實驗原理是將捕獲抗體結(jié)合到ELISA板上,通過捕獲抗體固定抗原,,隨后通過直接ELISA或間接ELISA的方式進行檢測,。在夾心ELISA實驗中,,最重要的是對配對抗體進行驗證,確保配對抗體能同時與抗原結(jié)合,,以確保實驗的順利進行,。
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競爭ELISA (Competition ELISA)
競爭ELISA,先將特異性抗體包被于固相載體表面,,經(jīng)洗滌后分成兩組:一組加酶標記抗原和被測抗原的混合液,,另一組只加酶標記抗原,經(jīng)孵育洗滌后加底物顯色,,這兩組底物降解量之差,,即為所要測定的未知抗原的量。此方法測定的抗原只要有一個結(jié)合部位即可,,對小分子抗原如激素和藥物類的測定常用此法,。優(yōu)點是快,缺點是需要較多量的酶標記抗原,。在競爭ELISA實驗中,,樣品中的抗原或抗體競爭性的結(jié)合特定數(shù)量的酶標抗體或抗原。樣品中抗原濃度越高,,輸出信號越弱,,信號輸出與樣品中抗原的量成反比。
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