ELISA素來(lái)以靈敏度較高,、特異性較好的特點(diǎn)在臨床上得到了廣泛的應(yīng)用,。而它作為經(jīng)典的免疫檢測(cè)方法，雖然看似平常但是要真正將該實(shí)驗(yàn)做好并不容易,，酶標(biāo)板的讀值總是會(huì)不盡如人意,，可見實(shí)操中的各個(gè)環(huán)節(jié)對(duì)該實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)效果影響較大，如不注意，就會(huì)產(chǎn)生一些糟心的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,。跟小源一起來(lái)總結(jié)一下ELISA空白背景高的常見原因和處理方法吧!
常見原因有以下這些：
1）洗板不干凈
解決方法：
①充分洗滌：如果洗板的時(shí)間不夠,，會(huì)導(dǎo)致抗體殘留，陰性對(duì)照會(huì)顯色,，嘗試延長(zhǎng)洗板時(shí)間,，增加洗板頻率，在洗液中添加表面活性劑Tween-20,。
在洗板時(shí)要保證每步都洗滌完,，充分拍板直至孔內(nèi)沒有明顯的殘留液體。
②避免交叉污染：棄去洗液和孵育的抗體時(shí)避免交叉污染,，移液槍頭盡可能一次性使用,，拍板的濾紙不要反復(fù)使用。
2）顯色液變質(zhì)或者試劑過(guò)期
解決方法：檢查試劑盒有效期,，或使用新的試劑盒并按照說(shuō)明書要求保存試劑盒,。每次用剩下的顯色液最好不要回收，或者只回收洗凈的容器裝的顯色液,。
3）試劑稀釋有誤,，檢測(cè)抗體/酶結(jié)合物工作液濃度過(guò)高
解決方法：按照說(shuō)明書推薦的稀釋倍數(shù)稀釋抗體。
4）試劑盒組分未平衡
解決方法：試劑盒每個(gè)組分都需要平衡至室溫后進(jìn)行實(shí)驗(yàn),。
5）混用其他試劑盒試劑
解決方法：保證使用試劑盒內(nèi)完整的一套試劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn),，不同品牌及不同批次間的試劑可能存在不匹配現(xiàn)象，不同批號(hào)的試劑不要混用,。
6）蒸餾水受酶等污染
解決方法：使用新鮮蒸餾水,。
7）培養(yǎng)箱溫度超過(guò)37℃或反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)
解決方法：孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、溫度過(guò)高可能會(huì)導(dǎo)致非特異性結(jié)合增加,，從而造成本底增高,。檢查恒溫箱，確保孵育溫度穩(wěn)定在37℃,，按照說(shuō)明書的反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行孵育,。
8）酶標(biāo)板底部有污漬
解決方法：在加完終止液之后，檢測(cè)之前,，用75%乙醇浸潤(rùn)的脫脂棉球擦拭酶標(biāo)板底部,，確認(rèn)沒有污漬之后再檢測(cè)。
9）洗液被污染
解決方法：洗液現(xiàn)配現(xiàn)用,，長(zhǎng)期放置會(huì)析出,，也可能會(huì)污染，導(dǎo)致背景偏高,。
10）包被的抗原被污染
解決辦法：仔細(xì)回想操作過(guò)程,，換新的抗原包被,。
11）封閉液、封閉時(shí)間,、封閉液的濃度
解決辦法：封閉液（BSA）可能會(huì)與抗體產(chǎn)生交叉反應(yīng),。封閉液的濃度偏低、封閉時(shí)間過(guò)短導(dǎo)致封閉不che底,，抗體與酶標(biāo)板結(jié)合,，可能也會(huì)導(dǎo)致背景偏高，因此可以適當(dāng)調(diào)整封閉液的濃度和時(shí)間以降低背景,。
12）抗體質(zhì)量差或選擇的抗體不合適
解決辦法：抗體質(zhì)量不高,，特異性不好可能會(huì)與封閉液（BSA）產(chǎn)生交叉反應(yīng)，可以用0.8%明膠（明膠不含有血清成分）代替,。
若選擇多克隆抗體孵育,，可能會(huì)與酶標(biāo)單抗產(chǎn)生交叉反應(yīng)，導(dǎo)致背景增加,，最好選用與酶標(biāo)單抗同種屬的多克隆抗體,。
13）酶標(biāo)儀設(shè)置參數(shù)有誤
解決辦法：檢查酶標(biāo)儀設(shè)置的波長(zhǎng)，不同波長(zhǎng)下樣品的吸光光度值也會(huì)有很大的差別,，按照說(shuō)明書要求設(shè)置參數(shù),。
本期內(nèi)容：ELISA空白背景高的常見原因和處理方法
下期內(nèi)容：酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定ELISA實(shí)驗(yàn)類型有哪些？
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