當(dāng)找到有效的活性分子后......
這些分子的作用靶點(diǎn)是什么？
如何發(fā)揮它們的生物學(xué)效應(yīng),？
本期咱們一起探討藥物找靶的新策略,，Let’s Go!
Section.01
藥物靶點(diǎn)的識(shí)別
明確藥物的臨床適用范圍是藥物發(fā)現(xiàn)與設(shè)計(jì)的關(guān)鍵，除此之外,，闡明藥物的作用靶點(diǎn)也在疾病的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色,。
諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)得主 Paul Ehrlich 曾說過“corpora non agunt nisi fixate”—— 藥物不會(huì)發(fā)揮作用，除非它們被結(jié)合,?！杜＝蛏锘瘜W(xué)與分子生物學(xué)詞典》將藥物靶點(diǎn)定義為與特定化合物相互作用并受其活性調(diào)節(jié)的生物實(shí)體，通常是蛋白質(zhì)或基因,。
1. 在某種疾病的病理生理中有確鑿的作用，和/或能夠改變疾病進(jìn)程,；
2. 在全身范圍內(nèi)的非均勻分布,；
3. 有可用于評(píng)估成藥性的三維結(jié)構(gòu),；
4. 易于進(jìn)行“檢測(cè)”,，便于高通量篩選；
5. 具有良好的毒性特征,，可以通過表型數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)潛在的不良反應(yīng),；
6. 具有有利的知識(shí)產(chǎn)權(quán) (IP) 狀態(tài) (這一點(diǎn)主要與新藥研發(fā)公司相關(guān))。
新藥發(fā)現(xiàn)主要分為基于靶點(diǎn)的藥物發(fā)現(xiàn) (Target-based drug discovery, TDD) 和基于表型的藥物發(fā)現(xiàn) (Phenotypic drug discovery, PDD),。對(duì)于 PDD 來說,，從大規(guī)模化合物中篩選并驗(yàn)證得到活性分子后,，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)并闡明其作用靶點(diǎn)更是至關(guān)重要,！
藥物靶點(diǎn)識(shí)別的方法主要分為計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)與實(shí)驗(yàn)找靶。
計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)通常利用數(shù)據(jù)挖掘,、藥效團(tuán)模型匹配,、正反分子對(duì)接技術(shù)和藥物-靶標(biāo)相似性算法等，識(shí)別小分子可能作用的靶點(diǎn)。下面是一些常用的靶標(biāo)預(yù)測(cè)網(wǎng)站,，有需可參考喔~
表 1. 常用的靶標(biāo)預(yù)測(cè)網(wǎng)站,。
雖然通過預(yù)測(cè)的方法能夠快速篩選出大量潛在靶點(diǎn)，但精準(zhǔn)度相對(duì)不高,，而且通常無法定位到某種細(xì)胞或組織中,。由于靶點(diǎn)可能在不同的細(xì)胞中表達(dá)水平不同或發(fā)揮不同的作用，這種缺乏細(xì)胞特異性的預(yù)測(cè)可能會(huì)導(dǎo)致在實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證階段的失敗,。
實(shí)驗(yàn)找靶則是通過具體的生物實(shí)驗(yàn)來篩選靶點(diǎn),，其底層邏輯一般是通過各種實(shí)驗(yàn)方法找到細(xì)胞或組織中能夠與藥物結(jié)合的潛在蛋白，而后通過結(jié)合層面和功能層面的雙重驗(yàn)證來確認(rèn)靶點(diǎn)在疾病中的作用以及藥物可以通過調(diào)節(jié)該靶點(diǎn)功能從而發(fā)揮藥效,。這不僅能夠提高靶點(diǎn)篩選的準(zhǔn)確性,，也為靶點(diǎn)選擇提供了更豐富的生物學(xué)背景，使得藥物研發(fā)更具針對(duì)性和有效性,。
實(shí)驗(yàn)找靶常用的方法主要有 DARTS,、SPR 和 Pulldown 技術(shù)等，且看小 M 為大家逐一介紹~
Section.02
DARTS 找靶技術(shù)
藥物親和反應(yīng)靶點(diǎn)穩(wěn)定性（Drug affinity responsive target stability, DARTS）的概念最初由 Brett Lomenick 等人于 2009 年提出,，其基本原理是靶蛋白與小分子配體結(jié)合后穩(wěn)定性增加,，可以增強(qiáng)靶蛋白對(duì)蛋白酶酶解作用的抗性，以此來進(jìn)行靶蛋白篩選,，同時(shí)無需對(duì)小分子進(jìn)行修飾[2],。
DARTS 找靶的一般實(shí)驗(yàn)流程：
1. 蛋白庫的制備 (通常為目標(biāo)細(xì)胞或組織的蛋白裂解液)；
2. 蛋白裂解液與小分子共孵育,；
3. 蛋白酶水解 (合適的蛋白酶濃度至關(guān)重要),；
4. 通過考馬斯亮藍(lán)染色或銀染等方法檢測(cè)對(duì)照組和加藥組蛋白的差異；
5. 目標(biāo)蛋白凝膠條帶收集,；
6. 通過質(zhì)譜等方法對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行鑒定,。
圖 1. 利用 DARTS 技術(shù)找靶的流程。
作者通過表型篩選及驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)藥物 desloratadine 在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中都能夠顯著抑制肝細(xì)胞癌 (HCC) 的生長(zhǎng)和增殖,。為了探究 desloratadine 發(fā)揮抗癌生物活性的分子機(jī)制,，作者通過 DARTS 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了 53 種潛在靶蛋白，并從中選擇了 5 種感興趣的蛋白質(zhì)修飾酶進(jìn)行進(jìn)一步研究,。通過蛋白表達(dá),、Knockdown、細(xì)胞增殖,、細(xì)胞侵襲和遷移以及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)等驗(yàn)證了 desloratadine 通過靶向 NMT1 蛋白調(diào)節(jié) HCC 的發(fā)展,，利用 SPR 技術(shù)驗(yàn)證了 desloratadine 和 NMT1 蛋白的結(jié)合，通過分子對(duì)接,、蛋白點(diǎn)突變聯(lián)合 SPR 技術(shù)找到了 desloratadine 和 NMT1 蛋白的結(jié)合位點(diǎn),。
圖 2. 利用 DARTS 技術(shù)發(fā)現(xiàn) desloratadine 通過靶向 NMT1 蛋白調(diào)節(jié) HCC 的發(fā)展[3]。
Section.03
SPR 找靶技術(shù)
表面等離子共振 (Surface Plasmon Resonance, SPR) 是一種無標(biāo)記、實(shí)時(shí)檢測(cè)分子相互作用的技術(shù),。它基于表面等離子共振原理,，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)分子在固體表面 (通常是金屬表面) 上的結(jié)合與解離過程。
雖然 SPR 實(shí)驗(yàn)通常用來檢測(cè)兩個(gè)分子之間的相互作用,，但是 SPR 的這一特性也使其可以用于從復(fù)雜樣品中“垂釣”與藥物相互作用的分子,。
實(shí)驗(yàn)時(shí)，將藥物固定在芯片上,，蛋白裂解液稀釋為不同濃度,，采用多濃度上樣的方式，將不同濃度的裂解液與藥物互作,，收集與小分子結(jié)合的蛋白并通過高分辨質(zhì)譜進(jìn)行鑒定,，從而得到藥物的潛在靶蛋白。同時(shí),，SPR 技術(shù)也常用于靶蛋白與藥物的親和力驗(yàn)證,。
圖 3. 利用 SPR 技術(shù)找靶的流程。
作者通過細(xì)胞活力,、細(xì)胞凋亡等表型實(shí)驗(yàn)從 1,504 種 FDA 上市藥物中篩選并驗(yàn)證了 Lomitapide 對(duì)耐藥多發(fā)性骨髓瘤 (Multiple myeloma,，MM) 細(xì)胞有很好的抗腫瘤活性，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也證實(shí) lomitapide 可以抑制 MM 的疾病進(jìn)程,。
Section.04
SPIDER 鄰近標(biāo)記
Pull Down 技術(shù)
特異性糖基化作為標(biāo)識(shí)報(bào)告物 (Specific Pupylation as IDEntity Reporter, SPIDER) 是一種基于底物的鄰近標(biāo)記活性和鏈霉親和素 (SA)-生物素系統(tǒng)來識(shí)別蛋白質(zhì)-生物分子相互作用的方法,。
圖 5. SPIDER 技術(shù)原理示意圖。
對(duì)于實(shí)驗(yàn)找靶而言,，針對(duì)藥物特點(diǎn)選擇合適的實(shí)驗(yàn)方案尤為重要,，一起來看看上述 3 種藥物找靶技術(shù)各自的應(yīng)用范圍吧！
表 2. 不同藥物找靶技術(shù)的特點(diǎn)及應(yīng)用范圍。
那么有的小伙伴可能會(huì)問了,，找到潛在結(jié)合蛋白之后,，要如何驗(yàn)證這些靶點(diǎn)是否是疾病的靶點(diǎn)呢？活性分子又是否是通過某個(gè)靶點(diǎn)發(fā)揮藥效的呢,？別著急,，后續(xù)的驗(yàn)證方法小 M 也為你總結(jié)好了，噔噔噔噔~
表 3. 實(shí)驗(yàn)找靶后續(xù)驗(yàn)證方法舉例,。
看了小 M 的介紹,，大家現(xiàn)在有沒有一些找靶的思路了呢？MCE 藥物找靶平臺(tái)提供多種找靶技術(shù),，結(jié)合經(jīng)驗(yàn)豐富的蛋白表達(dá)純化和分子互作研究平臺(tái),，可以為藥物潛在靶點(diǎn)的識(shí)別和驗(yàn)證提供全面和個(gè)性化的實(shí)驗(yàn)方案。歡迎來和小 M 一起探討~
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[1] Isabella Gashaw, et al. What makes a good drug target?. Drug Discovery Today. 2012.S24-S30.
[2] Lomenick B, et al. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Proc Natl Acad Sci U S A. 2009;106(51):21984-21989.
[3] Tan, XP., et al. Blockade of NMT1 enzymatic activity inhibits N-myristoylation of VILIP3 protein and suppresses liver cancer progression. Sig Transduct Target Ther 8, 14 (2023).
[4] Honghao Zhang, et al.Targeting PARP14 with lomitapide suppresses drug resistance through the activation of DRP1-induced mitophagy in multiple myeloma. Cancer Letters.2024.
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