目錄:北京蘭博利德商貿(mào)有限公司>>分子生物學(xué)試劑>>PCR相關(guān)>> Long Taq DNA Ploymerase
| 供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 貨號 | LT0201 |
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Long Taq DNA Ploymerase
貨號：LT0201
儲存溫度：-20。C,，濃度5U/ul,。
產(chǎn)品組成、濃度
目錄編號 | LT0201-500U | LT0201-3000U |
LongTaq DNA Ploymerase | 500U | 3000U |
10xLongTaqBuffer （2.5mM Mg2+ Plus） | 1ml | 6*1ml |
產(chǎn)品介紹
一般PCR法具有一定的局限性,，特別是難以擴增5kb以上的長鏈DNA，這嚴重限制了PCR法的推廣和應(yīng)用,。通過改變PCR用DNA聚合酶,、PCR用Buffer、PCR擴增條件等,，使長鏈DNA的擴增成為可能,，這就是LA（Long and Accurate）PCR技術(shù)。本試劑盒所用的Long Taq是Taq聚合酶和有矯正作用的聚合酶的混合物,，這種聚合酶可以染色體和其他細胞器的DNA為模板高效進行PCR反應(yīng),。在人的染色體上可以擴增長度可達27kb的DNA片段，而以λDNA為模板則可擴增出高達40kb的片段,。
適用范圍
一般用于DNA片段的PCR擴增,、DNA標記、引物延伸,、序列測定,、DNA平末端加A等，產(chǎn)物可直接用于TA克隆。
建議循環(huán)條件
步驟 | 溫度 | 時間 | 循環(huán)數(shù)目 |
預(yù)變性 | 94,。C | 1-2min | 1 |
變性 | 94,。C | 10-20sec | 10 |
退火 | 65。C（視引物而定） | 30sec | |
延伸 | 68,。C | 45-60sec/kb* | |
變性 | 94,。C | 10-20sec | 15-20 |
退火 | 65。C（視引物而定） | 30sec | |
延伸 | 68,。C | 45-60sec/kb +1-20sec“自動延長"/循環(huán)* | |
最hou延伸 | 68,。C | 10min | 1 |
*擴增大片段尤其是20kb以上的片段建議15-30個循環(huán)，每個循環(huán)的延伸時間要增加10-15sec“自動延伸"時間,，如果PCR儀器沒有“自動延時"功能,，那么設(shè)定延伸時間建議在原有基礎(chǔ)上增加1-4min。
PCR片段長度（kb） | 延伸時間（min） | 自動延長/循環(huán)（sec） |
3 | 2 | 1 |
6 | 4 | 2 |
10 | 7 | 5 |
15 | 10 | 5 |
20 | 14 | 10 |
25 | 17 | 10 |
30 | 20 | 15 |
35 | 24 | 15 |
40 | 27 | 20 |
45 | 30 | 20 |
注意事項：
1.10xLong Taq Buffer pH值較高,，可能會形成【Mg(OH)2】沉淀,，使用蒨要充分溶解，并用Votex保證可能的沉淀重新溶解,，或者37,。C溫育5min，然后Votex充分混勻,。
2. 擴增長片段建議使用0.2ul薄壁管,。其他試管未經(jīng)測試。較厚的試管在92,。C時不能有效的使模板變性,。變性時，盡可能縮短變性時間,，降低變性溫度,。第yi步變性在92。C-94,。C下進行2min（GC含量高可能延長時間達5min）,。再循環(huán)過程中盡可能縮短變性時間（92。C-94,。C下進行10-15s）,，除非模板中富含GC，則95,。C下變性30s,，這可以防止DNA脫嘌呤和鏈斷裂，對于所需擴增的基因組DNA片段中長度超過12kb時,，應(yīng)盡可能降低變性溫度和時間,。變性需要的時間在不同PCR儀上稍有不同,。
3. 如果擴增片段GC含量高或者擴增片段比較長，可在反應(yīng)混合物中加入DMSO到終濃度1%-8%,，最changyong2%（小于30kb）或者4%（大于30kb）往往會改善擴增效果,。
4. 擴增長片段，引物一般終濃度為0.3-1uM,，長度最hao為27-36bp,；退火溫度一般在65。C-70,。C，此時退火溫度和延伸溫度基本一致,，可將退火延伸在一個溫度進行,，使用2階段擴增法,。當(dāng)然如果設(shè)計的引物在20bp左右,，則還是使用傳統(tǒng)3階段擴增法,。
5. 模板一般使用0.01-2.5ng(λ phage)或者0.1-1ug（human）,。
6. 1xLong Taq buffer中Mg2+濃度為2.5mM,，建議dNTP濃度為400mM，要得到最hao結(jié)果，優(yōu)化Mg2+是必須的,。如果含有較高的EDTA或螯合劑,，則應(yīng)該提高Mg2+,；如果要增加dNTP濃度,，相應(yīng)的也要增加Mg2+濃度,。
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