1,、引物最好在模板cDNA的保守區(qū)內(nèi)設(shè)計。
　　DNA序列的保守區(qū)是通過物種間相似序列的比較確定的,。在NCBI上搜索不同物種的同一基因,，通過序列分析軟件（比如DNAman）比對（Alignment），各基因相同的序列就是該基因的保守區(qū),。

　　2,、引物長度一般在15-30堿基之間。
　　引物長度（primer length）常用的是18-27bp,，但不應(yīng)大于38bp,，因為過長會導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，不適于Taq DNA 聚合酶進行反應(yīng),。

　　3,、引物GC含量在40%~60%之間，Tm值最好接近72℃,。
　　GC含量（composition）過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng),。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外,，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解鏈溫度,，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度,。有效啟動溫度,，一般高于Tm值5-10℃。若按公式Tm=4（G+C+2（A+T）估計引物的Tm值,，則有效引物的Tm為55-80℃,，其Tm值最好接近72℃以使復(fù)性條件最佳。

　　4,、引物3'端要避開密碼子的第3位,。
　　如擴增編碼區(qū)域，引物3'端不要終止于密碼子的第3位,，因密碼子的第3位易發(fā)生簡并,，會影響擴增的特異性與效率,。

　　5、引物3'端不能選擇A,，最好選擇T,。
　　引物3'端錯配時，不同堿基引發(fā)效率存在著很大的差異,，當(dāng)末位的堿基為A時,，即使在錯配的情況下，也能有引發(fā)鏈的合成,，而當(dāng)末位鏈為T時,，錯配的引發(fā)效率大大降低，G,、C錯配的引發(fā)效率介于A,、T之間，所以3'端最好選擇T,。

　　6,、堿基要隨機分布。
　　引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有相似性較高,，尤其是3’端相似性較高的序列,，否則容易導(dǎo)致錯誤引發(fā)（False priming）。降低引物與模板相似性的一種方法是,，引物中四種堿基的分布最好是隨機的,，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3'端不應(yīng)超過3個連續(xù)的G或C,，因這樣會使引物在GC富集序列區(qū)錯誤引發(fā),。

　　7、引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補序列,。
　　引物自身不應(yīng)存在互補序列,，否則引物自身會折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)（Hairpin）使引物本身復(fù)性。這種二級結(jié)構(gòu)會因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合,。引物自身不能有連續(xù)4個堿基的互補,。
　　兩引物之間也不應(yīng)具有互補性，尤其應(yīng)避免3'端的互補重疊以防止引物二聚體（Dimer與Cross dimer）的形成,。引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補,。
　　引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)如果不可避免的話，應(yīng)盡量使其△G值不要過高（應(yīng)小于4.5kcal/mol）,。否則易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚體帶,，并且降低引物有效濃度而使PCR 反應(yīng)不能正常進行。

　　8、引物5'端和中間△G值應(yīng)該相對較高,，而3'端△G值較低,。
　　△G值是指DNA 雙鏈形成所需的自由能，它反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對的相對穩(wěn)定性,，△G值越大,，則雙鏈越穩(wěn)定。應(yīng)當(dāng)選用5' 端和中間△G值相對較高,，而3'端△G值較低（絕對值不超過9）的引物,。引物3'端的△G 值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA聚合反應(yīng)（不同位置的△G值可以用Oligo 6軟件進行分析）,。

　　9,、引物的5'端可以修飾，而3'端不可修飾,。
　　引物的5' 端決定著PCR產(chǎn)物的長度,，它對擴增特異性影響不大。因此,，可以被修飾而不影響擴增的特異性。引物5'端修飾包括：加酶切位點,；標(biāo)記生物素,、熒光、di高辛,、Eu3+等,；引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列；引入點突變,、插入突變,、缺失突變序列；引入啟動子序列等,。
引物的延伸是從3'端開始的,，不能進行任何修飾。3'端也不能有形成任何二級結(jié)構(gòu)可能,。

　　10,、擴增產(chǎn)物的單鏈不能形成二級結(jié)構(gòu)。
　　某些引物無效的主要原因是擴增產(chǎn)物單鏈二級結(jié)構(gòu)的影響,，選擇擴增片段時最好避開二級結(jié)構(gòu)區(qū)域,。用有關(guān)軟件（比如RNAstructure）可以預(yù)測估計mRNA的穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu)，有助于選擇模板,。實驗表明,，待擴區(qū)域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol時，擴增往往不能成功。若不能避開這一區(qū)域時,，用7-deaza-2'-脫氧GTP取代dGTP對擴增的成功是有幫助的,。

　　11、引物應(yīng)具有特異性,。
　　引物設(shè)計完成以后,，應(yīng)對其進行BLAST檢測。如果與其它基因不具有互補性,，就可以進行下一步的實驗了,。

　　值得一提的是，各種模板的引物設(shè)計難度不一,。有的模板本身條件比較困難,，例如GC含量偏高或偏低，導(dǎo)致找不到各種指標(biāo)都十分合適的引物,；用作克隆目的的PCR,，因為產(chǎn)物序列相對固定，引物設(shè)計的選擇自由度較低,。在這種情況只能退而求其次,，盡量去滿足條件。

　　做Real Time時,，用于SYBR Green I法時的一對引物與一般PCR的引物,，在引物設(shè)計上所要求的參數(shù)是不同的。引物設(shè)計的要求：
　?。?）避免重復(fù)堿基,，尤其是G。
　?。?）Tm=58-60度,。
　　（3）GC=30-80%,。
　?。?）3'端最后5個堿基內(nèi)不能有多于2個的G或C.
　　（5）正向引物與探針離得越近越好,，但不能重疊,。
　　（6）PCR擴增產(chǎn)物長度： 引物的產(chǎn)物大小不要太大,，一般在80-250bp之間都可,；80-150bp最為合適（可以延長至300 bp）。
　?。?）引物的退火溫度要高,，一般要在60度以上,；

　　要特別注意避免引物二聚體和非特異性擴增的存在。

　　而且引物設(shè)計時應(yīng)該考慮到引物要有不受基因組DNA污染影響的能力,，即引物應(yīng)該跨外顯子,，最好是引物能跨外顯子的接頭區(qū)，這樣可以更有效的不受基因組DNA污染的影響,。

　　至于設(shè)計軟件,，PRIMER3、PRIMER5,、PRIMER EXPRESS都應(yīng)該可以的,。

　　做染料法最關(guān)鍵的就是尋找到合適的引物和做污染的預(yù)防工作。對于引物,，你要有從一大堆引物中挑出一兩個能用的引物的思想準(zhǔn)備－尋找合適的引物非常不容易,。

　　關(guān)于BLAST的作用應(yīng)該是通過比對，發(fā)現(xiàn)你所設(shè)計的這個引物,，在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并在GENEBANK中公開的不物種基因序列當(dāng)中,，除了和你的目標(biāo)基因之外，還有沒有和其他物種或其他序列當(dāng)中存在相同的序列,，如和你的目標(biāo)序列之外的序列相同的序列,，則可能擴出其他序列的產(chǎn)物，那么這個引物的特異性就很差,，從而不能用,。