一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/strong>

1.掌握聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的原理,。

2. 掌握移液槍和PCR儀的基本操作技術(shù),。

二,、實(shí)驗(yàn)原理

PCR技術(shù)，即聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction,，PCR）是由美國PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年（1993年獲諾貝爾化學(xué)獎）建立的,。這項(xiàng)技術(shù)可在試管內(nèi)的經(jīng)數(shù)小時(shí)反應(yīng)就將特定的DNA片段擴(kuò)增數(shù)百萬倍，這種迅速獲取大量單一核酸片段的技術(shù)在分子生物學(xué)研究中具有舉足輕重的意義,，極大地推動了生命科學(xué)的研究進(jìn)展,。它不僅是DNA分析zui常用的技術(shù)，而且在DNA重組與表達(dá),、基因結(jié)構(gòu)分析和功能檢測中具有重要的應(yīng)用價(jià)值,。

PCR可以被認(rèn)為是與發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制過程相似的技術(shù)，其結(jié)果都是以原來的DNA為模板產(chǎn)生新的互補(bǔ)DNA片段,。細(xì)胞中DNA的復(fù)制是一個(gè)非常復(fù)雜的過程,。參與復(fù)制的有多種因素。PCR是在試管中進(jìn)行的DNA復(fù)制反應(yīng),，基本原理與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制相似,，但反應(yīng)體系相對較簡單。

PCR由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至94℃左右一定時(shí)間后,，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離,，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合,，為下輪反應(yīng)做準(zhǔn)備,；

②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右,，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合,；

③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在Taq酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料,，靶序列為模板,，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈,。

重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程,，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈"，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板,。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘， 2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍,。

三,、實(shí)驗(yàn)試劑與器材

模板DNA、2.5mmol/L dNTP

Taq DNA聚合酶（5U/μL）,、SSR引物

10 ×buffer,、15mmol/L Mg2+,、ddH2O

PCR儀、移液槍,、PCR板

四,、實(shí)驗(yàn)步驟

1、配制20μL反應(yīng)體系,，在PCR板中依次加入下列溶液：

模板DNA 2μL

引物1 1μL

引物2 1μL

dNTP 1.5μL

MgCl2 2μL

10×buffer 2μL

ddH2O 10μL

Taq酶 0.5