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初級(jí)會(huì)員 | 第4年

19121610072

蛋白質(zhì)免疫印跡（Western Blot,，WB ）

時(shí)間：2022/11/2閱讀：423
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實(shí)驗(yàn)方法原理Western免疫印跡,，是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上,，然后利用抗體進(jìn)行檢測(cè)的方法。對(duì)已知表達(dá)蛋白,，可用相應(yīng)抗體作為一抗進(jìn)行檢測(cè),，對(duì)新基因的表達(dá)產(chǎn)物，可通過(guò)融合部分的抗體檢測(cè),。

與Southern或Northern雜交方法類(lèi)似,，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測(cè)物是蛋白質(zhì),，探針是抗體,，顯色用標(biāo)記的二抗。

經(jīng)過(guò)PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品,，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上,，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類(lèi)型及其生物學(xué)活性不變,。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原,，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng),，經(jīng)過(guò)底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分,。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測(cè)蛋白水平的表達(dá)。
實(shí)驗(yàn)材料蛋白質(zhì)樣品
試劑,、試劑盒丙烯酰胺 SDS  Tris-HCl β-巰基乙醇 ddH2O 甘氨酸 Tris 甲醇 PBS NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 ddH2O考馬斯亮蘭 乙酸 脫脂奶粉 硫酸鎳胺 H2O2 DAB試劑盒
儀器,、耗材電泳儀 電泳槽 離心機(jī) 離心管 硝酸纖維素膜 勻漿器 剪刀 移液槍 刮棒
實(shí)驗(yàn)步驟
一、試劑準(zhǔn)備
 
1.  SDS-PAGE試劑：見(jiàn)聚丙烯酰胺凝膠電泳實(shí)驗(yàn)。
 
2.  勻漿緩沖液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml,；10%SDS 6.0 ml,；β-巰基乙醇 0.2 ml；ddH2O 2.8 ml,。
 
3.  轉(zhuǎn)膜緩沖液：甘氨酸 2.9 g,；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g,；甲醇200 ml,；加ddH2O定容至1000 ml。
 
4.  0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g,；KCl 0.2 g,；Na2HPO4 1.44 g；KH2PO4 0.24 g,；加ddH2O至1000 ml,。
 
5.  膜染色液：考馬斯亮蘭 0.2 g；甲醇80 ml,；乙酸2 ml,；ddH2O118 ml。包被液（5%脫脂奶粉,，現(xiàn)配）：脫脂奶粉1.0 g 溶于20 ml的0.01 M PBS中,。
 
6.  顯色液：DAB 6.0 mg；0.01 M PBS 10.0 ml,；硫酸鎳胺 0.1 ml,；H202 1.0 ul。

二,、蛋白樣品制備
 
1.   單層貼壁細(xì)胞總蛋白的提取
 
（1） 倒掉培養(yǎng)液,，并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液（或?qū)⑵恐绷⒎胖靡粫?huì)兒使殘余培養(yǎng)液流到瓶底然后再用移液器將其吸走）。
 
（2） 每瓶細(xì)胞加3 ml 4℃預(yù)冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）,。平放輕輕搖動(dòng)1 min洗滌細(xì)胞,，然后棄去洗液。重復(fù)以上操作兩次,，共洗細(xì)胞三次以洗去培養(yǎng)液。將PBS棄凈后把培養(yǎng)瓶置于冰上,。
 
（3）按1ml裂解液加10 ul PMSF（100 mM）,，搖勻置于冰上。（PMSF要搖勻至無(wú)結(jié)晶時(shí)才可與裂解液混合,。）
 
（4） 每瓶細(xì)胞加400 ul含PMSF的裂解液,，于冰上裂解30 min，為使細(xì)胞充分裂解培養(yǎng)瓶要經(jīng)常來(lái)回?fù)u動(dòng)。
 
（5）裂解完后,，用干凈的刮棒將細(xì)胞刮于培養(yǎng)瓶的一側(cè)（動(dòng)作要快）,，然后用槍將細(xì)胞碎片和裂解液移至1.5 ml離心管中。（整個(gè)操作盡量在冰上進(jìn)行,。）
 
（6）于4℃下12000 rpm離心5 min,。（提前開(kāi)離心機(jī)預(yù)冷）
 
（7） 將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移倒0.5 ml的離心管中放于－20℃保存。
 
2.   組織中總蛋白的提取
 
（1）將少量組織塊置于1～2 ml勻漿器中球狀部位,，用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎,。
 
（2） 加400 uL單去污劑裂解液裂（含PMSF）于勻漿器中，進(jìn)行勻漿,。然后置于冰上,。
 
（3）幾分鐘后再碾一會(huì)兒再置于冰上，要重復(fù)碾幾次使組織盡量碾碎,。
 
（4） 裂解30 min后,，即可用移液器將裂解液移至1.5 ml離心管中，然后在4℃下12000 rpm離心5 min,，取上清分裝于0.5 ml離心管中并置于－20℃保存,。
 
3.   加藥物處理的貼壁細(xì)胞總蛋白的提取
 
由于受藥物的影響，一些細(xì)胞脫落下來(lái),，所以除按1操作外還應(yīng)收集培養(yǎng)液中的細(xì)胞,。以下是培養(yǎng)液中細(xì)胞總蛋白的提取：
 
（1）將培養(yǎng)液倒至15 ml離心管中,，于2500 rpm離心5 min,。
 
（2）棄上清，加入4 ml PBS并用槍輕輕吹打洗滌,，然后2500 rpm離心5 min,。棄上清后用PBS重復(fù)洗滌一次。
 
（3）用槍洗干上清后,，加100 uL裂解液（含PMSF）冰上裂解30 min,，裂解過(guò)程中要經(jīng)常彈一彈以使細(xì)胞充分裂解。
 
（4）將裂解液與培養(yǎng)瓶中裂解液混在一起4℃,、12000 rpm離心5 min,，取上清分裝于0.5 ml離心管中并置于－20℃保存。
 
三,、 蛋白含量的測(cè)定
 
1.  制作標(biāo)準(zhǔn)曲線
 
（1）從－20℃取出1 mg/ml BSA,，室溫融化后，備用,。
 
（2）取18個(gè)1.5 ml離心管,，3個(gè)一組,，分別標(biāo)記為0 mg，2.5 mg,，5.0 mg,，10.0 mg，20.0 mg,，40.0 mg,。
 
（3）按下表在各管中加入各種試劑。

（4） 混勻后,，室溫放置2 min,。在生物分光光度計(jì)（Bio-Photometer，Eppendorf）上比色分析,。
 
2.  檢測(cè)樣品蛋白含量
 
（1）取足量的1.5 ml離心管,，每管加入4℃儲(chǔ)存的考馬斯亮藍(lán)溶液1 ml。室溫放置30 min后即可用于測(cè)蛋白,。
 
（2） 取一管考馬斯亮藍(lán)加0.15 mol/L NaCl溶液100 ml,，混勻放置2分鐘可做為空白樣品，將空白倒入比色杯中在做好標(biāo)準(zhǔn)曲線的程序下按blank測(cè)空白樣品,。
 
（3）棄空白樣品,，用無(wú)水乙醇清洗比色杯2次（每次0.5 mL），再用無(wú)菌水洗一次,。
 
（4）取一管考馬斯亮藍(lán)加95 ml 0.15 mol/L NaCl NaCl溶液和5 ml待測(cè)蛋白樣品,，混勻后靜置2 min，倒入扣干的比色杯中按sample鍵測(cè)樣品,。
 
注意：每測(cè)一個(gè)樣品都要將比色杯用無(wú)水乙醇洗2次,，無(wú)菌水洗一次?？赏瑫r(shí)混合好多個(gè)樣品再一起測(cè),，這樣對(duì)測(cè)定大量的蛋白樣品可節(jié)省很多時(shí)間。測(cè)得的結(jié)果是5 ml樣品含的蛋白量,。
 
四,、SDS－PAGE電泳
 
1.  清洗玻璃板
 
一只手扣緊玻璃板，另一只手蘸點(diǎn)洗衣粉輕輕擦洗,。兩面都擦洗過(guò)后用自來(lái)水沖,，再用蒸餾水沖洗干凈后立在筐里晾干。
 
2.  灌膠與上樣
 
（1）玻璃板對(duì)齊后放入夾中卡緊,。然后垂直卡在架子上準(zhǔn)備灌膠,。（操作時(shí)要使兩玻璃對(duì)齊，以免漏膠,。）
 
（2）按前面方法配10%分離膠,，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。灌膠時(shí),，可用10 ml槍吸取5 ml膠沿玻璃放出,，待膠面升到綠帶中間線高度時(shí)即可。然后膠上加一層水,，液封后的膠凝的更快,。（灌膠時(shí)開(kāi)始可快一些，膠面快到所需高度時(shí)要放慢速度,。操作時(shí)膠一定要沿玻璃板流下,，這樣膠中才不會(huì)有氣泡。加水液封時(shí)要很慢,，否則膠會(huì)被沖變型,。）
 
（3）當(dāng)水和膠之間有一條折射線時(shí)，說(shuō)明膠已凝了,。再等3 min使膠充分凝固就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干,。
 
（4）按前面方法配4%的濃縮膠,加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿(mǎn)濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中,。灌膠時(shí)也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產(chǎn)生,。插梳子時(shí)要使梳子保持水平。由于膠凝固時(shí)體積會(huì)收縮減小,，從而使加樣孔的上樣體積減小,，所以在濃縮膠凝固的過(guò)程中要經(jīng)常在兩邊補(bǔ)膠。待到濃縮膠凝固后,，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出,。
 
（5）用水沖洗一下濃縮膠，將其放入電泳槽中,。（小玻璃板面向內(nèi),，大玻璃板面向外。若只跑一塊膠,，那槽另一邊要墊一塊塑料板且有字的一面面向外,。）
 
（6）測(cè)完蛋白含量后，計(jì)算含50 ng蛋白的溶液體積即為上樣量,。取出上樣樣品至0.5 ml離心管中,，加入5×SDS 上樣緩沖液至終濃度為1×。（上樣總體積一般不超過(guò)15 ul,，加樣孔的最大限度可加20 ul樣品,。）上樣前要將樣品于沸水中煮5 min使蛋白變性。
 
（7） 加足夠的電泳液后開(kāi)始準(zhǔn)備上樣,。（電泳液至少要漫過(guò)內(nèi)測(cè)的小玻璃板,。）用微量進(jìn)樣器貼壁吸取樣品,，將樣品吸出不要吸進(jìn)氣泡。將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品,。（加樣太快可使樣品沖出加樣孔,，若有氣泡也可能使樣品溢出。加入下一個(gè)樣品時(shí),，進(jìn)樣器需在外槽電泳緩沖液中洗滌3次,，以免交叉污染。
 
3.   電泳
 
電泳時(shí)間一般4～5 h,，電壓為40 V較好,，也可用60 V。電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳,，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜,。
 
五、轉(zhuǎn)膜
 
1.   轉(zhuǎn)一張膜需準(zhǔn)備6張7.0～8.3 cm的濾紙和1張7.3～8.6 cm的硝酸纖維素膜,。切濾紙和膜時(shí)一定要戴手套,，因?yàn)槭稚系牡鞍讜?huì)污染膜。將切好的硝酸纖維素膜置于水上浸2 h才可使用,。（用鑷子捏住膜的一邊輕輕置于有超純水的平皿里,，要使膜浮于水上，只有下層才與水接觸,。這樣由于毛細(xì)管作用可使整個(gè)膜浸濕,。若膜沉入水里，膜與水之間形成一層空氣膜,，這樣會(huì)阻止膜吸水,。
 
2.   在加有轉(zhuǎn)移液的搪瓷盤(pán)里放入轉(zhuǎn)膜用的夾子、兩塊海綿墊,、一支玻棒,、濾紙和浸過(guò)的膜,。
 
3.   將夾子打開(kāi)使黑的一面保持水平,。在上面墊一張海綿墊，用玻棒來(lái)回?fù){幾遍以搟走里面的氣泡,。（一手搟另一手要壓住墊子使其不能隨便移動(dòng),。）在墊子上墊三層濾紙（可三張紙先疊在一起在墊于墊子上），一手固定濾紙一手用玻棒搟去其中的氣泡,。
 
4.  要先將玻璃板撬掉才可剝膠,，撬的時(shí)候動(dòng)作要輕，要在兩個(gè)邊上輕輕的反復(fù)撬,。撬一會(huì)兒玻璃板便開(kāi)始松動(dòng)，直到撬去玻板。（撬時(shí)一定要小心,，玻板很易裂。）除去小玻璃板后,，將濃縮膠輕輕刮去（濃縮膠影響操作），要避免把分離膠刮破,。小心剝下分離膠蓋于濾紙上，用手調(diào)整使其與濾紙對(duì)齊,，輕輕用玻棒搟去氣泡,。將膜蓋于膠上，要蓋滿(mǎn)整個(gè)膠（膜蓋下后不可再移動(dòng)）并除氣泡,。在膜上蓋3張濾紙并除去氣泡,。最后蓋上另一個(gè)海綿墊，搟幾下就可合起夾子,。整個(gè)操作在轉(zhuǎn)移液中進(jìn)行,，要不斷的搟去氣泡。膜兩邊的濾紙不能相互接觸,，接觸后會(huì)發(fā)生短路,。（轉(zhuǎn)移液含甲醇，操作時(shí)要戴手套,，實(shí)驗(yàn)室要開(kāi)門(mén)以使空氣流通,。）
 
5.  將夾子放入轉(zhuǎn)移槽槽中，要使夾的黑面對(duì)槽的黑面,，夾的白面對(duì)槽的紅面,。電轉(zhuǎn)移時(shí)會(huì)產(chǎn)熱，在槽的一邊放一塊冰來(lái)降溫,。一般用60 V轉(zhuǎn)移2 h或40 V轉(zhuǎn)移3 h,。
 
6.  轉(zhuǎn)完后將膜用1×麗春紅染液染5 min（于脫色搖床上搖）。然后用水沖洗掉沒(méi)染上的染液就可看到膜上的蛋白,。將膜晾干備用,。
 
六、免疫反應(yīng)
 
1 .  將膜用TBS從下向上浸濕后,，移至含有封閉液的平皿中,，室溫下脫色搖床上搖動(dòng)封閉1h。
 
2.   將一抗用TBST稀釋至適當(dāng)濃度（在1.5 ml離心管中）,；撕下適當(dāng)大小的一塊兒保鮮膜鋪于實(shí)驗(yàn)臺(tái)面上,，四角用水浸濕以使保鮮膜保持平整；將抗體溶液加到保鮮膜上,；從封閉液中取出膜,，用濾紙吸去殘留液后,，將膜蛋白面朝下放于抗體液面上，掀動(dòng)膜四角以趕出殘留氣泡,；室溫下孵育1～2 h后,，用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次10 min,；再用TBS洗一次,，10 min。
 
3.  同上方法準(zhǔn)備二抗稀釋液并與膜接觸,，室溫下孵育1～2 h后,，用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次10 min,；再用TBS洗一次,，10 min，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng),。
 
七,、化學(xué)發(fā)光，顯影,，定影
 
1.  將A和B兩種試劑在保鮮膜上等體積混合,；1 min后，將膜蛋白面朝下與此混合液充分接觸,；1 min后,，將膜移至另一保鮮膜上，去盡殘液,，包好,，放入X-光片夾中。
 
2.   在暗室中,，將1×顯影液和定影液分別到入塑料盤(pán)中,；在紅燈下取出X－光片，用切紙刀剪裁適當(dāng)大?。ū饶さ拈L(zhǎng)和寬均需大1 cm）,；打開(kāi)X-光片夾，把X－光片放在膜上,，一旦放上,，便不能移動(dòng)，關(guān)上X-光片夾,，開(kāi)始計(jì)時(shí),；根據(jù)信號(hào)的強(qiáng)弱適當(dāng)調(diào)整曝光時(shí)間，一般為1 min或5 min，也可選擇不同時(shí)間多次壓片,，以達(dá)最佳效果,；曝光完成后，打開(kāi)X-光片夾,，取出X-光片,，迅速浸入顯影液中顯影，待出現(xiàn)明顯條帶后,，即刻終止顯影,。顯影時(shí)間一般為1～2 min（20～25℃），溫度過(guò)低時(shí)（低于16℃）需適當(dāng)延長(zhǎng)顯影時(shí)間,；顯影結(jié)束后,，馬上把X-光片浸入定影液中，定影時(shí)間一般為5～10 min,，以膠片透明為止；用自來(lái)水沖去殘留的定影液后,，室溫下晾干,。
 
應(yīng)注意的是：顯影和定影需移動(dòng)膠片時(shí)，盡量拿膠片一角,，手指甲不要?jiǎng)潅z片,，否則會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響。
 
八,、凝膠圖象分析
 
將膠片進(jìn)行掃描或拍照,，用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的分子量和凈光密度值。
注意事項(xiàng)

1.  一抗,、二抗的稀釋度,、作用時(shí)間和溫度對(duì)不同的蛋白要經(jīng)過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳條件。
 

2.  顯色液必須新鮮配置使用,，最后加入H2O2,。
 

3.  DAB有致癌的潛在可能，操作時(shí)要小心仔細(xì),。
 

其他

一,、免疫反應(yīng)
 

1.  用0.01 M PBS洗膜，5 min × 3次,。
 

2.  加入包被液,，平穩(wěn)搖動(dòng)，室溫2 h,。
 

3.  棄包被液,，用0.01 M PBS洗膜，5 min × 3次。
 

4.  加入一抗（按合適稀釋比例用0.01 M PBS稀釋?zhuān)后w必須覆蓋膜的全部）,，4℃ 放置12 h以上,。陰性對(duì)照，以1%BSA取代一抗,，其余步驟與實(shí)驗(yàn)組相同,。
 

5.  棄一抗和1%BSA，用0.01 M PBS分別洗膜,，5 min×4次,。
 

6.  加入辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的二抗（按合適稀釋比例用0.01 M  PBS稀釋?zhuān)椒€(wěn)搖動(dòng),，室溫2 h,。
 

7.  棄二抗，用0.01 M PBS洗膜,，5 min×4次,。
 

8.  加入顯色液，避光顯色至出現(xiàn)條帶時(shí)放入雙蒸水中終止反應(yīng),。


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