一、擴(kuò)增方式
擴(kuò)增方式一般有兩種,，對(duì)稱擴(kuò)增和不對(duì)稱擴(kuò)增,。
1、對(duì)稱擴(kuò)增
使用等量的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,，擴(kuò)增產(chǎn)物量隨著PCR循環(huán)呈指數(shù)增長(zhǎng),，一般的PCR，使用的都是這種方式,。
由于TaqDNA聚合酶具有5’-3’外切酶活性,，在PCR擴(kuò)增的過(guò)程中會(huì)水解探針，導(dǎo)致探針被耗盡,，無(wú)法用于熔曲分析,；若使用抗酶切修飾的探針，可一定程度降低水解,，但由于探針阻礙了聚合酶通過(guò),，擴(kuò)增效率會(huì)大幅下降。
對(duì)稱擴(kuò)增產(chǎn)生的互補(bǔ)雙鏈,，會(huì)與探針競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合靶序列,，不利于探針結(jié)合到靶序列上，熔曲分析可能會(huì)出現(xiàn)異常,。
優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高
缺點(diǎn)：一般搭配使用媒介探針進(jìn)行檢測(cè),，而其他類型探針由于被切割而無(wú)法使用。
2,、不對(duì)稱擴(kuò)增
上下游引物中,，有一條引物為過(guò)量使用，一條引物xian量使用,，在PCR擴(kuò)增的前期,，擴(kuò)增產(chǎn)物量呈指數(shù)增長(zhǎng),，待xian量引物耗盡，擴(kuò)增產(chǎn)物量呈線性增長(zhǎng),，產(chǎn)生大量的單鏈用于探針的結(jié)合和熔解曲線分析,。
LATE-PCR方法中，由于考慮到引物濃度對(duì)引物Tm值的影響,，xian量引物由于濃度低,，對(duì)模板的結(jié)合效率下降，從而影響不對(duì)稱擴(kuò)增前期的擴(kuò)增效率,，因此對(duì)xian量引物的Tm值進(jìn)行了增加（即加多幾個(gè)堿基）,。
優(yōu)點(diǎn)：不會(huì)消耗探針，探針可用于后續(xù)熔解曲線分析
缺點(diǎn)：靈敏度低,，一般用于基因檢測(cè),，不適用于病原檢測(cè)（病原檢測(cè)需要高靈敏度）
二、如何降低非特異性擴(kuò)增,？
1,、HANDS技術(shù)（Homo-Tag Assisted Non-Dimer System，同源加尾無(wú)二聚體系統(tǒng)）
通過(guò)對(duì)引物添加標(biāo)簽,，當(dāng)形成引物二聚體后,，由于首尾的序列互補(bǔ)，會(huì)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu),，不再作為模板進(jìn)行擴(kuò)增。
2,、DPO引物（Dual Priming Oligonucleotide,，雙啟動(dòng)寡核苷酸）
DPO引物主要由三個(gè)部分組成，長(zhǎng)的 5'端片段,、短的3'端片段,、中間起連接作用的聚脫氧次黃嘌呤(poly I)。由于脫氧次黃嘌呤與天然堿基結(jié)合較弱,，因此相當(dāng)于與模板DNA形成了一個(gè)氣泡結(jié)構(gòu),。
即使DPO引物的較長(zhǎng)的 5'端部分結(jié)合到了非靶序列部位，但由于熱力學(xué)限制,，3’端部分阻止了非特異結(jié)合并有效地阻斷了延伸,。同樣由于熱力學(xué)限制，單獨(dú)的3'端部分在PCR退火溫度下不能結(jié)合到靶序列上,。從而減少引物二聚體的擴(kuò)增,。
3、touch-down技術(shù)
即降落PCR,，在退火階段,，采用逐級(jí)降溫的方式,，能有效減少非特異性擴(kuò)增。溫度較高時(shí),，由于非特異性結(jié)合的結(jié)合力較弱,，不利于非特異性擴(kuò)增，特異性擴(kuò)增占優(yōu)勢(shì),。
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