細(xì)胞凍存是細(xì)胞保存的主要方法之一,，利用凍存技術(shù)將細(xì)胞冷凍保存在-196℃液氮中，可以使細(xì)胞暫時(shí)停止生長(zhǎng)并保留細(xì)胞特性,，以便在需要時(shí)再復(fù)蘇細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn),。同時(shí)保存適量的細(xì)胞，可以防止細(xì)胞在培養(yǎng)過程中因受到污染或其他意外事件導(dǎo)致細(xì)胞丟種,，起到細(xì)胞保種的作用,。
細(xì)胞凍存和復(fù)蘇采取“慢凍快融"的原則，慢速冷凍可使細(xì)胞內(nèi)的水份滲出細(xì)胞外,，減少細(xì)胞內(nèi)形成冰晶的機(jī)會(huì),；快融以保證細(xì)胞外結(jié)晶快速融化，避免慢速融化水份滲入細(xì)胞內(nèi),，再次形成胞內(nèi)冰晶造成對(duì)細(xì)胞的損傷,。
細(xì)胞凍存時(shí)需向培養(yǎng)基中加入冷凍保護(hù)劑，可保護(hù)細(xì)胞在冷凍時(shí)免受溶液損傷和冰晶損傷,。冷凍保護(hù)劑可根據(jù)其是否穿透細(xì)胞膜分為滲透性和非滲透性兩類：
1.滲透性冷凍保護(hù)劑可以滲透到細(xì)胞內(nèi),，一般是一些小分子物質(zhì)，主要包括甘油,、DMSO,、乙二醇、丙二醇,、乙酰胺,、甲醇等,。
2.非滲透性冷凍保護(hù)劑不能滲透到細(xì)胞內(nèi)，一般是些大分子物質(zhì),，主要包括聚乙烯吡咯烷酮（PVP）,、蔗糖、聚乙二醇,、葡聚糖,、白蛋白以及羥YI基淀粉等。
（一）細(xì)胞凍存一般步驟
1. 準(zhǔn)備已滅菌的凍存培養(yǎng)液,，并4℃預(yù)冷,；
2. 選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，棄掉細(xì)胞培養(yǎng)液,，用細(xì)胞消化酶（如胰蛋白酶）進(jìn)行消化,，適時(shí)去掉消化液，加入少量新鮮培養(yǎng)液,。懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞不進(jìn)行消化處理，直接將細(xì)胞收集于離心管中離心,，1000 rpm,，5-10 min；
3. 棄去上清液,，逐漸加入適量預(yù)冷的凍存培養(yǎng)液,，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，計(jì)數(shù),，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度在5×106～1×107/mL之間,；
4. 將上述細(xì)胞分裝于2 mL凍存管中，每管1-1.5 mL,。在凍存管上標(biāo)明細(xì)胞名稱,、凍存日期和操作者；
5. 凍存：標(biāo)準(zhǔn)的降溫速率開始為-1～-2℃/ min,，當(dāng)溫度降到-80℃時(shí),，可迅速浸入液氮中。也可將裝有細(xì)胞的凍存管放入-20℃冰箱2 h ,，然后放入-80℃冰箱中過夜,，取出凍存管，移入液氮容器內(nèi),。
（二）注意事項(xiàng)
1. 配制好的細(xì)胞凍存液要進(jìn)行預(yù)冷，新鮮配制的凍存液會(huì)產(chǎn)生大量的熱,。
2. 凍存的細(xì)胞在半年后,，建議取出一只凍存管細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng),，觀察生長(zhǎng)情況，然后再繼續(xù)凍存,。
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