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多聚半乳糖醛酸酶（ploygalacturonase，PG）試劑盒說明書

   微量法100T/48S

注    意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定,。

測(cè)定意義：

多聚半乳糖醛酸酶（EC3.2.1.15）是一種細(xì)胞壁結(jié)合蛋白,，可以催化果膠分子中α-(1,4)-聚半乳糖醛酸的裂解,，參與果膠的降解，使細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)解體,，導(dǎo)致果實(shí)軟化,，與果實(shí)成熟、葉和花的脫落,、病原物防御,，細(xì)胞伸展發(fā)育以及木質(zhì)化有關(guān)，在植物抗病性和食品貯藏保鮮領(lǐng)域具有較高的研究?jī)r(jià)值,。

測(cè)定原理：

多聚半乳糖醛酸酶水解果膠酸生成半乳糖醛酸,，具有還原性醛基，與DNS試劑反應(yīng)生成紅棕色物質(zhì),，在540nm有特征吸收峰,，測(cè)定540nm處吸光值變化可計(jì)算得多聚半乳糖醛酸酶活性。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：

天平,、低溫離心機(jī),、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板,、恒溫水浴鍋,。

試劑組成和配制：

提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存,。

試劑一：液體8mL×1瓶,，4℃保存。

試劑二：液體15mL×1瓶,，4℃避光保存,。

酶液提取：

1．組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織,，加入1mL提取液）,，進(jìn)行冰浴勻漿。16000g 4℃離心10min,，取上清,，置冰上待測(cè)。

2．細(xì)菌,、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w,，超聲3秒,，間隔7秒，總時(shí)間3min）,；然后16000g,，4℃離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。

3．培養(yǎng)液：直接檢測(cè),。

測(cè)定操作表：

多聚半乳糖醛酸酶（PG）試劑盒酶活性計(jì)算公式

a.        用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 3.9642x - 0.008,；R² = 0.9996,；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度，mg/mL,；y為吸光值,。

1．按照蛋白濃度計(jì)算

酶活性定義：在40℃，pH6.0條件下,，每毫克蛋白每小時(shí)分解果膠酸產(chǎn)生1mg半乳糖醛酸為一個(gè)酶活力單位,。

PG活性（mg/h/mg prot）= (ΔA+0.008) ÷3.9642×V反總÷（V樣×Cpr）÷T

= 2.523×(ΔA+0.008)÷Cpr

2．按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活性定義：在40℃，pH6.0條件下,，每克樣本每小時(shí)分解果膠酸產(chǎn)生1mg半乳糖醛酸為一個(gè)酶活力單位,。

PG活性（mg/h/g 鮮重）=(ΔA+0.008) ÷3.9642×V反總÷（V樣×W÷V樣總）÷T

= 2.523×(ΔA+0.008)÷W

3．按液體體積計(jì)算

酶活性定義：在40℃，pH6.0條件下,，每毫升培養(yǎng)液每小時(shí)分解果膠酸產(chǎn)生1mg半乳糖醛酸為一個(gè)酶活力單位,。

PG活性（mg/h/mL）=(ΔA+0.008) ÷3.9642×V反總÷V樣÷T=2.523×(ΔA+0.008)

4. 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活性定義：在40℃，pH6.0條件下,，每10⁴個(gè)細(xì)胞每小時(shí)分解果膠酸產(chǎn)生1mg半乳糖醛酸為一個(gè)酶活力單位,。

PG活性（mg/h/10⁴cell）=(ΔA+0.008) ÷3.9642×V反總÷（V樣×細(xì)胞數(shù)量÷V樣總）÷T

= 2.523×(ΔA+0.008)÷細(xì)胞數(shù)量   

V反總：反應(yīng)總體積，0.15mL,；V樣：反應(yīng)中樣本體積,，0.03mL；V樣總：加入提取液體積,，1mL,；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL,；W,，樣本質(zhì)量，g,；T：反應(yīng)時(shí)間,，0.5h

b.       用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 1.9821x - 0.008，R² = 0.9996,；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度,，mg/mL,；y為吸光值。

1．按照蛋白濃度計(jì)算

酶活性定義：在40℃,，pH6.0條件下,，每毫克蛋白每小時(shí)分解果膠酸產(chǎn)生1mg半乳糖醛酸為一個(gè)酶活力單位。

PG活性（mg/h/mg prot）=(ΔA+0.008) ÷1.9821×V反總÷（V樣×Cpr）÷T

= 5.045×(ΔA+0.008)÷Cpr

2．按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活性定義：在40℃,，pH6.0條件下,，每克樣本每小時(shí)分解果膠酸產(chǎn)生1mg半乳糖醛酸為一個(gè)酶活力單位（U）。

PG活性（mg/h/g 鮮重）=(ΔA+0.008) ÷1.9821×V反總÷（V樣×W÷V樣總）÷T

= 5.045×(ΔA+0.008)÷W

3．按液體體積計(jì)算

酶活性定義：在40℃,，pH6.0條件下,，每毫升培養(yǎng)液每小時(shí)分解果膠酸產(chǎn)生1mg半乳糖醛酸為一個(gè)酶活力單位（U）。

PG活性（mg/h/mL）=(ΔA+0.008) ÷1.9821×V反總÷V樣÷T=5.045×(ΔA+0.008)

4. 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活性定義：在40℃,，pH6.0條件下,，每10⁴個(gè)細(xì)胞每小時(shí)分解果膠酸產(chǎn)生1mg半乳糖醛酸為一個(gè)酶活力單位（U）。

PG活性（mg/h/10⁴cell）=(ΔA+0.008) ÷1.9821×V反總÷（V樣×細(xì)胞數(shù)量÷V樣總）÷T

= 5.045×(ΔA+0.008)÷細(xì)胞數(shù)量

V反總：反應(yīng)總體積,，0.15mL,；V樣：反應(yīng)中樣本體積，0.03mL,；V樣總：加入提取液體積,，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度,，mg/mL,；W，樣本質(zhì)量,，g,；T：反應(yīng)時(shí)間，0.5h

多聚半乳糖醛酸酶（PG）試劑盒注意事項(xiàng)：

煮沸樣本建議將樣本在沸水中煮沸10分鐘,，以將酶徹di滅活,。