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果膠裂解酶（pectinate lyases,，PL）試劑盒說明書

                                          微量法100T/48S

注    意：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定,。

測定意義：

果膠裂解酶（EC4.2.2.10）是果膠酶的重要組成部分，是一種能降解植物細胞壁,，導致植物組織軟化甚至死亡的解聚酶,，來源比較廣泛，主要來源于微生物,，可用于果汁,、果酒的澄清，提高水果出汁率,，植物病毒的純化,，紙漿的漂白和紡織品的生物精煉，在減少環(huán)境污染和降低能源消耗方面具有潛在的應用價值,。

測定原理：

果膠裂解酶作用于果膠中的α-1,4糖苷鍵,，生成在還原端C4和C5之間位置具有不飽和鍵的不飽和寡聚半乳糖醛酸，在235nm處有特征吸收峰,。

自備實驗用品及儀器：

天平,、低溫離心機、紫外分光光度計/酶標儀,、微量石英比色皿/96孔板（UV板）,、恒溫水浴鍋。

試劑組成和配制：

提取液：液體100mL×1瓶,，4℃保存,。

試劑一：液體6mL×1瓶，4℃保存,。

試劑二：液體6mL×1瓶,，4℃保存。

試劑三：液體6mL×1瓶,，4℃保存,。

酶液提取：

1．組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織,，加入1mL提取液）,，進行冰浴勻漿。10000g ,，4℃離心10min,，取上清，置冰上待測,。

2．細菌,、真菌：按照細胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL提取液）,，冰浴超聲波破碎細胞（功率300w,，超聲3秒,，間隔7秒，總時間3min）,；然后10000g,，4℃，離心10min,，取上清置于冰上待測,。

3. 培養(yǎng)液：直接測定。

測定操作表：

1,、   分光光度計/酶標儀預熱30min,，調(diào)節(jié)波長至235nm，蒸餾水調(diào)零,。

2,、   操作表

酶活性計算公式：

a.        用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1. 組織中PL活性

（1）按照蛋白濃度計算

酶活性定義：在40℃，pH5.5條件下,，每毫克蛋白每分鐘分解果膠產(chǎn)生1nmol不飽和半乳糖醛酸所需的酶量為一個酶活力單位,。

PL活性（nmol/min/mg prot）= △A÷（ε×d）×V反總÷（V樣×Cpr）÷T

= 64.1×△A÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計算

酶活性定義：在40℃，pH5.5條件下,，每克組織每分鐘分解果膠產(chǎn)生1nmol不飽和半乳糖醛酸所需的酶量為一個酶活力單位,。

PL活性（nmol/min/g 鮮重）= △A÷（ε×d）×V反總÷（V樣×W÷V樣總）÷T

= 64.1×△A÷W

2. 細菌、真菌PL活性

酶活性定義：在40℃,，pH5.5條件下,，每10⁴個細胞每分鐘分解果膠產(chǎn)生1nmol不飽和半乳糖醛酸所需的酶量為一個酶活力單位。

PL活性（nmol/min/10⁴cell）= △A ÷（ε×d）×V反總÷（V樣×細胞數(shù)量÷V樣總）÷T

 = 64.1×△A÷細胞數(shù)量

3. 培養(yǎng)液PL活性

酶活性定義：在40℃,，pH5.5條件下,，每毫升培養(yǎng)液每分鐘分解果膠產(chǎn)生1nmol不飽和半乳糖醛酸所需的酶量為一個酶活力單位。

PL活性（nmol/min/mL）= △A÷（ε×d）×V反總÷V樣÷T

= 64.1×△A

ε：不飽和半乳糖醛酸摩爾消光系數(shù)：5200L/mol/cm,；d：比色皿光徑,，1cm；V反總：反應總體積,，0.2mL,；V樣：反應體系中樣本體積，0.02mL,；V樣總：加入提取液體積,，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL,；W,，樣本質(zhì)量，g,；T：反應時間,，30min

b.       用96孔板測定的計算公式如下

1. 組織中PL活性

（1）按照蛋白濃度計算

酶活性定義：在40℃，pH5.5條件下,，每毫克蛋白每分鐘分解果膠產(chǎn)生1nmol不飽和半乳糖醛酸所需的酶量為一個酶活力單位,。

PL活性（nmol/min/mg prot）= △A÷（ε×d）×V反總÷（V樣×Cpr）÷T

= 128.2×△A÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計算

酶活性定義：在40℃，pH5.5條件下,，每克組織每分鐘分解果膠產(chǎn)生1nmol不飽和半乳糖醛酸所需的酶量為一個酶活力單位,。

PL活性（nmol/min/g 鮮重）= △A÷（ε×d）×V反總÷（V樣×W÷V樣總）÷T

= 128.2×△A÷W

2. 細菌、真菌PL活性

酶活性定義：在40℃,，pH5.5條件下,，每10⁴個細胞每分鐘分解果膠產(chǎn)生1nmol不飽和半乳糖醛酸所需的

酶量為一個酶活力單位。

PL活性（nmol/min/10⁴cell）=△A÷（ε×d）×V反總÷（V樣×細胞數(shù)量÷V樣總）÷T

    = 128.2×△A÷細胞數(shù)量

3. 培養(yǎng)液PL活性

酶活性定義：在40℃,，pH5.5條件下,，每毫升培養(yǎng)液每分鐘分解果膠產(chǎn)生1nmol不飽和半乳糖醛酸所需的酶量為一個酶活力單位。

PL活性（nmol/min//mL）= △A÷（ε×d）×V反總÷V樣÷T

= 128.2×△A

ε：不飽和半乳糖醛酸摩爾消光系數(shù)：5200L/mol/cm,；d：比色皿光徑,，0.5cm；V反總：反應總體積,，0.2mL,；V樣：反應體系中樣本體積，0.02mL,；V樣總：加入提取液體積,，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度,，mg/mL,；W，樣本質(zhì)量,，g,；T：反應時間，30min

果膠裂解酶（pectinate lyases,，PL）試劑盒僅供科研,！