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NADP蘋果酸脫氫酶（NADP-MDH）試劑盒說明書

                                微量法100管/96樣

注    意：正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義：

MDH （EC 1.1.1.37）廣泛存在于動物,、植物,、微生物和培養(yǎng)細胞中，線粒體中MDH是TCA循環(huán)的關鍵酶之一,，催化蘋果酸形成草酰乙酸,；相反，胞漿中MDH催化草酰乙酸形成蘋果酸,。草酰乙酸是重要的中間產(chǎn)物,， 連接多條重要的代謝途徑,。因此,，MDH在細胞多種生理活動中扮演著重要的角色，包括線粒體的能量代謝,、 蘋果酸-天冬氨酸穿梭系統(tǒng),、活性氧代謝和抗病性等。根據(jù)不同的輔酶特異性,，MDH分為NAD-依賴的MDH和NADP-依賴的MDH,， NADP-MDH主要存在于真核細胞中。

測定原理：

NADP-MDH催化NADPH還原草酰乙酸生成蘋果酸,，導致340nm處光吸收下降,。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計/酶標儀、臺式離心機,、水浴鍋,、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板和蒸餾水,。

試劑的組成和配制：

試劑一,、提取液100 mL×1瓶,，在4℃保存；

試劑二,、液體20 mL×1瓶,，在4℃保存；

試劑三,、粉劑×1瓶,，-20℃保存；

樣本測定的準備：

1,、細菌,、細胞或組織樣品的制備：

細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清,；按照細菌或細胞數(shù)量（10⁴個）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL試劑一）,，超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W,，超聲3s,，間隔10s，重復30次）,；8000g 4℃離心10min,，取上清，置冰上待測,。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織,，加入1mL試劑一），進行冰浴勻漿,。8000g 4℃離心10min,，取上清，置冰上待測,。

2,、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1,、  分光光度計或酶標儀預熱30min以上,，調(diào)節(jié)波長至340nm，蒸餾水調(diào)零,。

2,、檢測工作液的配制：用時在試劑三中加入19mL試劑二和0.5mL蒸餾水，充分混勻待用,；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復凍融；

3,、測定前將檢測工作液在37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴10min以上,。

4,、在微量石英比色皿或96孔板中加入5μL樣本和195μL工作液，混勻后立即記錄340nm處20s時的吸光值A1和 1min20s后的吸光值A2,，計算ΔA=A1-A2,。

注意：若A1-A2大于0.5，需將酶液用提取液稀釋,，使A1-A2小于0.5,，可提高檢測靈敏度。計算公式中乘

以相應稀釋倍數(shù),。

NADP-MDH活力單位的計算：

a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1,、血清（漿）NADP-MDH活力的計算

單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘消耗1 nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。

NADP-MDH（nmol/min/mL）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷V樣÷T=6430×ΔA

2,、組織,、細菌或細胞中NADP-MDH活力的計算:

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。

NADP-MDH（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=6430×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol的NADPH定義為一個酶活力單位,。

NADP-MDH（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（W ×V樣÷V樣總）÷T =6430×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘消耗1 nmol的NADPH定義為一個酶活力單位,。

NADP-MDH（nmol/min/10⁴ cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（V樣÷V樣總×500）÷T=12.86×ΔA

V反總：反應體系總體積，2×10^-4 L,；ε：NADPH摩爾消光系數(shù),，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑,，1cm,；V樣：加入樣本體積，0.005 mL,；V樣總：加入提取液體積,，1 mL；T：反應時間,，1 min,；W：樣本質(zhì)量，g,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL,；500：細胞或細菌總數(shù),，500萬。

b. 用96孔板測定的計算公式如下

1,、血清（漿）NADP-MDH活力的計算

單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘消耗1 nmol的NADPH定義為一個酶活力單位,。

NADP-MDH（nmol/min/mL）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷V樣÷T=12860×ΔA

2、組織,、細菌或細胞中NADP-MDH活力的計算:

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADPH定義為一個酶活力單位,。

NADP-MDH（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=12860×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol的NADPH定義為一個酶活力單位,。

NADP-MDH（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（W× V樣÷V樣總）÷T =12860×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘消耗1 nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。

NADP-MDH（nmol/min/10⁴ cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（500×V樣÷V樣總）÷T=25.72×ΔA

V反總：反應體系總體積,，2×10^-4 L,；ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm,；d：96孔板光徑,，0.5cm；V樣：加入樣本體積,，0.005 mL,；V樣總：加入提取液體積，1 mL,；T：反應時間,，1 min；W：樣本質(zhì)量,，g,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL,；500：細胞或細菌總數(shù),，500萬。

NADP蘋果酸脫氫酶（NADP-MDH）試劑盒僅供科研,！