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單脫氫抗壞血酸還原酶（MDHAR）測定試劑盒說明書

微量法100T/96S

注　意：正式測定之前選擇 2-3 個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義：

MDHAR 催化 MDHA 還原生成 AsA,，在抗壞血酸氧化還原代謝中具有重要作用,。

測定原理：

MDHAR 催化 NADH 還原 MDHA 生成 AsA 和 NAD⁺，NADH 在 340 nm 有特征吸收峰,，但是 NAD⁺沒有,。通過測定 340 nm 光吸收下降速率，來計算出 MDHAR 活性,。

實驗中所需儀器及設(shè)備：

研缽,、冰、臺式離心機(jī),、紫外分光光度計/酶標(biāo)儀,、微量石英比色皿/96 孔板、可調(diào)式移液槍和雙蒸水

試劑組成和配置：

試劑一：液體 100mL×1 瓶,，4℃保存,。

試劑二：液體 20mL×1 瓶，室溫保存,。

試劑三：粉劑×1 瓶（棕色）,，4℃保存。臨用前加入 3 mL 蒸餾水充分溶解,。

試劑四：粉劑×1 瓶,，4℃保存。臨用前加入 2.5 mL 蒸餾水充分溶解,。

試劑五：液體 15μL×1 瓶,，4℃保存。臨用前加 3 mL 試劑二充分溶解,。

粗酶液提?。?/span>

1.        組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿,。8000g,，4℃離心 10min，取上清置冰上待測,。

2. . 細(xì)菌,、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個）：試劑一體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建

議 500 萬細(xì)胞加入 1mL 試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w,，超聲 3 秒,，間隔 7 秒,，總時間 3min）；8000g ,，4℃離心 20min，取上清液置冰上混勻待測,。

3.        血清等液體：直接測定,。

MDHAR 測定操作：

1.    分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱 30 min，調(diào)節(jié)波長到 340 nm,，蒸餾水調(diào)零,。

2.    試劑二在 25℃水浴鍋中預(yù)熱 30 min。

3.依次在微量石英比色皿/96 孔板中加入 20μL 試劑三,、20μL 試劑四,、20μL 試劑五和 120μL 試劑二，最后加入 20μL 上清液,，迅速混勻后于 340nm 比色,，記錄 30s 和 150s 的吸光值 30s

和 150s 的吸光值 A1 和 A2，△A=A1-A2,。

MDHAR 活性計算公式：

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

(1). 按蛋白濃度計算

MDHAR 活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化 1nmol NADH 為 1 個酶活單位,。 MDHAR (nmol/min /mg prot) = △A÷ε÷d×V 反總×10⁹]÷（Cpr×V 樣）÷T

= 804×△A ÷Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計算

MDHAR 活性單位定義：25℃中每克樣本每分鐘氧化 1nmol NADH 為 1U。 MDHAR (nmol/min /g 鮮重) = △A÷ε÷d×V 反總×10⁹]÷（W×V 樣÷V 樣總）÷T

= 804×△A ÷W

（3）按細(xì)胞數(shù)量計算

MDHAR 活性單位定義：25℃中每 10⁴ 個細(xì)胞每分鐘氧化 1nmol NADH  為 1 個酶活單位,。

MDHAR (nmol/min/10⁴ cell) = △A÷ε÷d×V 反總×10⁹÷（細(xì)胞數(shù)量×V 樣÷V 樣總）÷T = 804×△A ÷ 細(xì)胞數(shù)量

（4）按液體體積計算

MDHAR 活性單位定義：25℃中每毫升液體每分鐘氧化 1nmol NADH 為 1 個酶活單位,。 MDHAR (nmol/min /mL) = △A÷ε÷d×V 反總×10⁹÷V 樣）÷T

= 804×△A

ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6220 L/mol/cm,；d：比色皿光徑,，1cm；V 反總：反應(yīng)體系總體積,，0.2mL=2×10^-4L,；V 樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，20μL=0.02mL,；V 樣總：提取液體積,，

1  mL；Cpr：上清液蛋白濃度,，mg/mL,，蛋白質(zhì)濃度需要另外測定，建議使用本公司蛋白質(zhì)含量 BCA 試劑盒,；W ：樣品質(zhì)量,；T：反應(yīng)時間，2min,。

b.使用 96 孔板測定的計算公式如下：

(1). 按蛋白濃度計算

MDHAR 活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化 1nmol NADH 為 1 個酶活單位,。 MDHAR (nmol/min /mg prot) = △A÷ε÷d×V 反總×10⁹]÷（Cpr×V 樣）÷T

= 1608×△A ÷Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計算

MDHAR 活性單位定義：25℃中每克樣本每分鐘氧化 1nmol NADH 為 1U,。 MDHAR (nmol/min /g 鮮重) = △A÷ε÷d×V 反總×10⁹]÷（W×V 樣÷V 樣總）÷T

= 1608×△A ÷W

（3）按細(xì)胞數(shù)量計算

MDHAR 活性單位定義：25℃中每 10⁴ 個細(xì)胞每分鐘氧化 1nmol NADH 為 1 個酶活單位。 MDHAR (nmol/min/10⁴ cell) = △A÷ε÷d×V 反總×10⁹÷（細(xì)胞數(shù)量×V 樣÷V 樣總）÷T

= 1608×△A ÷  細(xì)胞數(shù)量

（4）按液體體積計算

MDHAR 活性單位定義：25℃中每毫升液體每分鐘氧化 1nmol NADH 為 1 個酶活單位,。 MDHAR (nmol/min /mL) = △A÷ε÷d×V 反總×10⁹÷V 樣）÷T

=1608×△A

ε：NADH 摩爾消光系數(shù),，6220 L/mol/cm；d：96 孔板光徑,，0.5cm,；V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.2mL=2×10^-4L,；V 樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積,，20μL=0.02mL；V 樣總：提取液體積,，1 mL,；Cpr：上清液蛋白濃度，mg/mL,，蛋白質(zhì)濃度需要另外測定,，建議使用本公司蛋白質(zhì)含量 BCA 試劑盒；W ：樣品質(zhì)量,；T：反應(yīng)時間,，2min。

單脫氫抗壞血酸還原酶（MDHAR）測定試劑盒注意事項：

臨用前配制的試劑未使用完的 4℃保存,，3 天內(nèi)使用完,。