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6-磷酸葡萄糖脫氫酶（G6PDH）試劑盒說明書

                                          微量法100管/96樣

注    意：正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

G6PDH（EC 1.1.1.49）廣泛存在于動(dòng)物,、植物,、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，是磷酸戊糖途徑的關(guān)鍵酶,，催化 6-磷酸葡萄糖氧化為 6 -磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯,，同時(shí)將NADP⁺還原為NADPH，供生物合成及維持細(xì)胞內(nèi)的還原狀態(tài)用,。因此6-磷酸葡萄糖脫氫酶活性的高低可以從一定程度上反映出生物體的生物合成和抗氧化能力,。

測(cè)定原理：

G6PDH催化NADP⁺還原生成NADPH，在340 nm下測(cè)定NADPH增加速率,。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀,、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī),、可調(diào)式移液器,、微量石英比色皿/96孔板,、研缽、冰和蒸餾水,。

試劑的組成和配制：

提取液：液體100mL×1瓶,，4℃保存；

試劑一：液體19 mL×1瓶,，4℃保存,；

試劑二：粉劑×1瓶，-20℃保存,；

試劑三：粉劑×1瓶,，-20℃保存；

樣本的前處理：

1,、細(xì)菌,、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清,；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為1000~5000：1的比例（建議2000萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液）,，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W,，超聲3s,，間隔10s，重復(fù)30次）,；8000g 4℃離心10min,，取上清，置冰上待測(cè),。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織,，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿,。8000g 4℃離心10min,，取上清，置冰上待測(cè),。

2,、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

G6PDH測(cè)定操作表：

1,、  分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm，蒸餾水調(diào)零,。

2,、   將試劑二和試劑三轉(zhuǎn)移至試劑一中充分溶解；在37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）水浴10min以上；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復(fù)凍融,。

3、   在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本和190μL試劑一,，混勻后立即記錄340nm處1min后吸光值A1和 6min后的吸光值A2,，計(jì)算ΔA=A2-A1。 

注意事項(xiàng)：

若ΔA大于0.5,，需將酶液用提取液稀釋,，計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)?；?qū)⒎磻?yīng)時(shí)間縮短至2min,，使A2-A1

小于0.5，可提高檢測(cè)靈敏度,。

G6PDH活力單位的計(jì)算：

a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1,、血清（漿）G6PDH活力的計(jì)算:

單位的定義：每mL血清（漿）每分鐘生成1 nmol的NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

G6PDH（nmol/min/mL）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷V樣÷T=643×ΔA

2,、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中G6PDH活力的計(jì)算:

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位,。

G6PDH（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=643×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g組織每分鐘生成1 nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位,。

G6PDH（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=643×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成1 nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

G6PDH（nmol/min /10⁴ cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(2000×V樣÷V樣總) ÷T=0.3215×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積,，2×10^-4 L,；ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm,；d：比色皿光徑,，1cm；V樣：加入樣本體積,，0.01 mL,；V樣總：加入提取液體積，1 mL,；T：反應(yīng)時(shí)間,，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量，g,；2000：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),，2000萬。

b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、血清（漿）G6PDH活力的計(jì)算:

單位的定義：每mL血清（漿）每分鐘生成1 nmol的NADPH定義為一個(gè)酶活力單位,。

G6PDH（nmol/min /mL）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷V樣÷T=1286×ΔA

2,、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中G6PDH活力的計(jì)算:

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位,。

G6PDH（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷ (V樣×Cpr) ÷T=1286×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g組織每分鐘生成1 nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位,。

G6PDH（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=1286×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成1 nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

G6PDH（nmol/min /10⁴ cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(2000×V樣÷V樣總) ÷T=0.643×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積,，2×10^-4 L,；ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm,；d：96孔板光徑,，0.5cm；V樣：加入樣本體積,，0.01 mL,；V樣總：加入提取液體積，1 mL,；T：反應(yīng)時(shí)間,，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量，g,；2000：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),，2000萬。

6-磷酸葡萄糖脫氫酶（G6PDH）試劑盒僅供科研,！