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胞漿異檸檬酸脫氫酶（ICDHc）試劑盒說明書

                                     微量法100管/96樣

注    意：正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

ICDHc（EC 1.1.1.42）廣泛存在于動物,、植物,、微生物和培養(yǎng)細胞中,，催化異檸檬酸脫氫脫羧生成 α-酮戊二酸,，同時還原NADP⁺生成NADPH。ICDHc是細胞質(zhì)中除了磷酸戊糖途徑外又一種NADPH重要來源,，在逆境中該酶活性通常會發(fā)生顯著變化,。

測定原理：

利用ICDHc催化NADP⁺還原成NADPH反應(yīng)，在340 nm下測定NADPH濃度的增加,。

所需的儀器和用品:

紫外分光光度計/酶標(biāo)儀,、恒溫水浴鍋、臺式離心機,、可調(diào)式移液器,、微量石英比色皿/96孔板、研缽,、冰和蒸餾水,。

試劑的組成和配制：

提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存,；

試劑一：液體19 mL×1瓶,，4℃保存,；

試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存,；

試劑三：粉劑×1瓶,，-20℃保存；

樣本的前處理：

1,、細菌,、細胞或組織樣品的制備：

細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清,；按照細菌或細胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液）,，超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W,，超聲3s,，間隔10s，重復(fù)30次）,；8000g 4℃離心10min,，取上清，置冰上待測,。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織,，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿,。8000g 4℃離心10min,，取上清，置冰上待測,。

2,、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1,、  分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,，調(diào)節(jié)波長至340nm，蒸餾水調(diào)零,。

2,、   將試劑二和試劑三轉(zhuǎn)移至試劑一中充分溶解；在37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴10min以上,；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復(fù)凍融。

3,、 在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本和190μL試劑一,，混勻后立即記錄340nm處20s后吸光值A1和 2min20s后的吸光值A2，計算ΔA=A2-A1。

注意事項：

1,、   若A2-A1大于0.5,，需將酶液用提取液稀釋，使A2-A1小于0.5,，可提高檢測靈敏度,。計算公式中乘以

       相應(yīng)稀釋倍數(shù)。

2,、   若A2-A1小于0.005,，可延長反應(yīng)時間到5min或10min。

ICDHc活力單位的計算：

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1,、血清（漿）ICDHc活力的計算:

單位的定義：每mL血清（漿）每分鐘生成1 nmol NADPH定義為一個酶活力單位,。

ICDHc（nmol/min/mL）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷V樣÷T=1608×ΔA

2、組織,、細菌或細胞中ICDHc活力的計算:

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol NADPH定義為一個酶活力單位。

ICDHc（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘生成1 nmol NADPH定義為一個酶活力單位,。

ICDHc（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=1608×ΔA÷W

（3） 按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘生成1 nmol的NADPH定義為一個酶活力單位,。

ICDHc（nmol/min/10⁴）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=3.216×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10^-4 L,；ε：NADPH摩爾消光系數(shù),，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑,，1cm,；V樣：加入樣本體積，0.01 mL,；V樣總：加入提取液體積,，1 mL；T：反應(yīng)時間,，2 min,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量,，g；500：細菌或細胞總數(shù),，500萬,。

b.用96孔板測定的計算公式如下

1、血清（漿）ICDHc活力的計算：

單位的定義：每mL血清（漿）每分鐘生成1 nmol NADPH定義為一個酶活力單位,。

ICDHc（nmol/min/mL）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷V樣÷T=3216×ΔA

2,、組織、細菌或細胞中ICDHc活力的計算：

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol NADPH定義為一個酶活力單位,。

ICDHc（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=3216×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘生成1 nmol NADPH定義為一個酶活力單位,。

ICDHc（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V樣÷V樣總)  ÷T=3216×ΔA÷W

（3） 按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘生成1 nmol的NADPH定義為一個酶活力單位,。

ICDHc（nmol/min/10⁴）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=6.432×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10^-4 L,；ε：NADPH摩爾消光系數(shù),，6.22×10³ L / mol /cm；d：96孔板光徑,，0.5cm,；V樣：加入樣本體積，0.01 mL,；V樣總：加入提取液體積,，1 mL；T：反應(yīng)時間,，2 min,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量,，g；500：細菌或細胞總數(shù),，500萬,。

胞漿異檸檬酸脫氫酶（ICDHc）試劑盒僅供科研！