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NAD-蘋果酸酶（NAD-ME）試劑盒說明書

                                        微量法100管/96樣

注    意：正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

ME廣泛存在于微生物、培養(yǎng)細(xì)胞,、動(dòng)物和植物胞漿中,，尤其在植物組織中活性較高。ME催化蘋果酸氧化脫羧的可逆反應(yīng),，產(chǎn)生丙酮酸和CO₂,，以及伴隨NAD(P)⁺的還原反應(yīng)，是蘋果酸代謝的關(guān)鍵酶,。ME活性與生物合成和抗氧化密切相關(guān),。近年來(lái)植物ME活性測(cè)定較多，已經(jīng)成為抗氧化研究的熱點(diǎn),。根據(jù)輔酶專一性和對(duì)底物特異性的不同,，可將ME分為NAD-ME(EC1.1.1.38)和NADP-ME(EC1.1.1.40)。

測(cè)定原理：

NAD-ME催化NAD⁺還原成NADH,，在340nm下測(cè)定NADH增加速率,。

需自備的儀器和用品:

紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋,、臺(tái)式離心機(jī),、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板和蒸餾水,。

試劑的組成和配制：

提取液：100mL×1瓶,，4℃保存。,；

試劑一：液體20mL×1瓶,，4℃保存,；

試劑二：液體10mL×1瓶,，4℃保存；

試劑三：粉劑×1瓶,，-20℃保存,；

樣本的前處理：

1,、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),，離心后棄上清,；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴,，功率20％或200W，超聲3s,，間隔10s,，重復(fù)30次）,；8000g 4℃離心10min，取上清,，置冰上待測(cè)。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織,，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿,。8000g 4℃離心10min,，取上清，置冰上待測(cè),。

2,、血清（漿）樣品：直接檢測(cè),。

測(cè)定步驟：

1,、  分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm,，蒸餾水調(diào)零,。

2、   檢測(cè)工作液的配制：用時(shí)在試劑三中加入15mL試劑一和1mL蒸餾水,，充分混勻待用,；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融,。

3,、   測(cè)定前將檢測(cè)工作液在37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）水浴10min以上。

4、在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本,、55μL試劑二和160μL工作液,，混勻后立即記錄340nm處初始吸光值A1和 1min后的吸光值A2，計(jì)算ΔA=A2-A1,。

注意：如果ΔA＜0.005,，可將反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)到2分鐘或5分鐘。

NAD-ME活性計(jì)算：

a. 用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位,。

NAD-ME（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T= 3617×ΔA÷Cpr

此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g組織每分鐘生成1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位,。

NAD-ME（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T = 3617×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位,。

NAD-ME（nmol/min/10⁴ cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T =7.234×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，2.25×10^-4 L,；ε：NADH摩爾消光系數(shù),，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑,，1cm,；V樣：加入樣本體積，0.01 mL,；V樣總：加入提取液體積,，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間,，1 min,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量,，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),，500萬(wàn),。

b . 用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

NAD-ME（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(Cpr×V樣) ÷T= 7234×ΔA÷Cpr

此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度,。

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g組織每分鐘生成1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位,。

NAD-ME（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣÷V樣總×W) ÷T = 7234×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

NAD-ME（nmol/min/10⁴ cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣÷V樣總×500) ÷T =14.468×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積,，2.25×10^-4 L,；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol,；d：96孔板光徑,，0.5cm；V樣：加入樣本體積,，0.01 mL,；V樣總：加入提取液體積,，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間,，1 min,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量,；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬(wàn),。

NAD-蘋果酸酶（NAD-ME）試劑盒僅供科研,！