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NADP蘋果酸酶（NADP-ME）試劑盒說明書

                                          微量法100管/96樣

注   意 ： 正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

ME廣泛存在于微生物、培養(yǎng)細胞,、動物和植物胞漿中，尤其在植物組織中活性較高,。ME催化蘋果酸氧化脫羧的可逆反應(yīng),，產(chǎn)生丙酮酸和CO₂，以及伴隨NAD(P)⁺的還原反應(yīng),，是蘋果酸代謝的關(guān)鍵酶,。ME活性與生物合成和抗氧化密切相關(guān)。近年來植物ME活性測定較多,，已經(jīng)成為抗氧化研究的熱點,。根據(jù)輔酶專一性和對底物特異性的不同，可將ME分為NAD-ME(EC1.1.1.38)和NADP-ME(EC1.1.1.40),。

測定原理：

NADP-ME催化NADP⁺還原成NADPH,，在340nm下測定NADPH增加速率。

需自備的儀器和用品:

紫外分光光度計/酶標(biāo)儀,、水浴鍋,、臺式離心機,、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板和蒸餾水,。

試劑的組成和配制：

提取液：100mL×1瓶,，4℃保存。,；

試劑一：液體30mL×1瓶,，4℃保存；

試劑二：粉劑×1瓶,，-20℃保存,； 臨用前加入20mL試劑一充分振蕩，溶解待用,，用不完的試劑分裝后-20度保存,，禁止反復(fù)凍融。

試劑三：粉劑×1瓶,，-20℃保存,；臨用前加入2.5mL蒸餾水充分振蕩，溶解待用,，用不完的試劑分裝后-20度保存,，禁止反復(fù)凍融。

樣本的前處理：

1,、細菌,、細胞或組織樣品的制備：

細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清,；按照細菌或細胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液）,，超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W,，超聲3s,，間隔10s，重復(fù)30次）,；14000g 4℃離心10min,，取上清，置冰上待測,。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織,，加入1mL提取液）,，進行冰浴勻漿,。14000g 4℃離心10min，取上清,，置冰上待測,。

2,、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1,、  分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,，調(diào)節(jié)波長至340nm，蒸餾水調(diào)零,。

2,、在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本和170μL試劑二，混勻,，30℃孵育5min,，加入20μL試劑三，混勻后立即記錄340nm處初始吸光值A1和 1min后的吸光值A2,，計算ΔA=A2-A1,。

NADP-ME活性計算：

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol NADPH定義為一個酶活力單位。

NADP-ME（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T= 3215×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度,。

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘生成1 nmol NADPH定義為一個酶活力單位,。

NADP-ME（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T = 3215×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘生成1 nmol NADPH定義為一個酶活力單位。

NADP-ME（nmol/min/10⁴ cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T =6.43×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積,，2×10^-4 L,；ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm,；d：比色皿光徑,，1cm；V樣：加入樣本體積,，0.01 mL,；V樣總：加入提取液體積，1 mL,；T：反應(yīng)時間,，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量，g,；500：細菌或細胞總數(shù),，500萬。

b.用96孔板測定的計算公式如下

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol NADPH定義為一個酶活力單位,。

NADP-ME（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(Cpr×V樣) ÷T= 6431×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度,。

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘生成1 nmol NADPH定義為一個酶活力單位。

NADP-ME（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣÷V樣總×W) ÷T = 6431×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘生成1 nmol NADPH定義為一個酶活力單位,。

NADP-ME（nmol/min/10⁴ cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣÷V樣總×500) ÷T =12.86×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積,，2×10^-4 L,；ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol/cm,；d：96孔板光徑,，0.5cm；V樣：加入樣本體積,，0.01 mL,；V樣總：加入提取液體積，1 mL,；T：反應(yīng)時間,，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量，g,；500：細菌或細胞總數(shù),，500萬。

NADP蘋果酸酶（NADP-ME）試劑盒僅供科研,！