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乙酰膽/堿酯酶（AchE）活性測定試劑盒說明書

                                            微量法100T/96S

注   意 ：正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義：

AchE屬于絲/氨酸水解酶,，廣泛存在于各種動物組織和血清中,。AchE催化乙酰膽/堿（Ach）水解，在神經(jīng)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)中起重要作用,。

測定原理：

AchE催化Ach水解生成膽/堿，膽/堿與二硫?qū)ο趸郊姿幔?/span>DTNB）作用生成5-巰基-硝基苯甲酸（TNB）,；TNB在412nm處有吸收峰,，通過測定412 nm吸光度增加速率，計算AchE活性,。

自備儀器和用品：

可見分光光度計/酶標(biāo)儀,、微量石英比色皿/96孔板、低溫離心機,、水浴鍋,、可調(diào)式移液槍和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體×1瓶,，4℃保存,。

試劑二：液體×1瓶，4℃保存,。

試劑三：粉劑×1支,，4℃保存。臨用前加入1.3 mL試劑二,，充分震蕩溶解,。

試劑四：粉劑×1支，4℃保存,。臨用前加入1.3 mL試劑二,，充分震蕩溶解。

粗酶液提?。?/span>

1.        組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織,，加入1mL試劑一）進行冰浴勻漿，8000g 4℃離心10min,，取上清液待測,。

2.        細菌、真菌：按照細胞數(shù)量（10⁴個）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL試劑一）,，冰浴超聲波破碎細胞（功率300w,，超聲3秒,，間隔7秒，總時間3min）,；然后8000g,，4℃，離心10min,，取上清置于冰上待測,。

3.        血清等液體：直接測定。

測定操作：

1.        分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min,，調(diào)節(jié)波長到412 nm,，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑二置于37℃水浴中預(yù)熱30min,。

3. 取微量石英比色皿/96孔板,，依次加入20μL上清液、160 μL試劑二,、10μL試劑三和10μL試劑四,，迅速混勻，于412nm處測定3min內(nèi)吸光值變化,，第10s吸光值記為A1,，第190s吸光值記為A2。△A測定管=A2-A1,。

AchE活性計算：

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1.        組織AchE活性

（1）按照蛋白濃度計算

活性單位定義：每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB的酶量為1個酶活單位,。

AchE酶活(nmol/min/mg prot)= (△A÷ε÷d×V反總×10⁹)÷（Cpr ×V樣）÷T

= 245×△A÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計算

活性單位定義：每克組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB的酶量為1個酶活單位。

AchE酶活(nmol/min/g 鮮重)= (△A÷ε÷d×V反總×10⁹)÷（W ×V樣÷V樣總）÷T

= 245×△A÷W

2.        細菌,、細胞AchE活性

活性單位定義：每10⁴個細胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB的酶量為1個酶活單位,。

AchE酶活(nmol/min/10⁴ cell)= (△A÷ε÷d×V反總×10⁹)÷（細胞數(shù)量×V樣÷V樣總）÷T

= 245×△A÷細胞數(shù)量

3.        血清AchE活性

活性單位定義：每毫升血清每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB的酶量為1個酶活單位。

AchE酶活(nmol/min /mL)= (△A÷ε÷d×V反總×10⁹)÷V樣÷T

=245×△A

ε：TNB摩爾消光系數(shù),，13.6×10³ L/mol/cm,；d：比色皿光徑，1 cm,；V反總：反應(yīng)體系總體積（L）,，200μL=2×10^-4L；V樣總：提取液體積,，1 mL,；10⁶：1mol=1×10⁶μmol；Cpr：蛋白濃度（mg/mL）,；V樣：加入上清液體積（mL）,，0.02 mL；W ：樣品質(zhì)量,；T：反應(yīng)時間（min）,，3 min,。

b.使用96孔板測定的計算公式如下

1.        組織AchE活性

（1）按照蛋白濃度計算

活性單位定義：每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB的酶量為1個酶活單位。

AchE酶活(nmol/min/mg prot)= (△A÷ε÷d×V反總×10⁹)÷（Cpr ×V樣）÷T

= 490×△A÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計算

活性單位定義：每克組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB的酶量為1個酶活單位,。

AchE酶活(nmol/min/g 鮮重)= (△A÷ε÷d×V反總×10⁹)÷（W ×V樣÷V樣總）÷T

= 490×△A÷W

2.        細菌,、細胞AchE活性

活性單位定義：每10⁴個細胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB的酶量為1個酶活單位。

AchE酶活(nmol/min/10⁴ cell)= (△A÷ε÷d×V反總×10⁹)÷（細胞數(shù)量×V樣÷V樣總）÷T

= 490×△A÷細胞數(shù)量

3.        血清AchE活性

活性單位定義：每毫升血清每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB的酶量為1個酶活單位,。

AchE酶活(nmol/min /mL)= (△A÷ε÷d×V反總×10⁹)÷V樣÷T

=490×△A

ε：TNB摩爾消光系數(shù),，13.6×10³ L/mol/cm；d：96孔板光徑,，0.5 cm,；V反總：反應(yīng)體系總體積（L），200μL=2×10^-4L,；V樣總：提取液體積,，1 mL；10⁶：1mol=1×10⁶μmol,；Cpr：蛋白濃度（mg/mL）,；V樣：加入上清液體積（mL）,，0.02 mL,；W ：樣品質(zhì)量；T：反應(yīng)時間（min）,，3 min,。

乙酰膽/堿酯酶（AchE）活性測定試劑盒僅供科研！