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脫氫抗壞血酸（DHA）含量測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)

                                                      微量法100T/96S

注    意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定,。

測(cè)定意義：

AsA作為植物細(xì)胞一個(gè)重要生理指標(biāo)，其AsA 的含量,、氧化還原狀態(tài)(AsA/DHA 比率)及其合成與代謝相關(guān)酶類活性的變化涉及植物對(duì)一系列環(huán)境脅迫的響應(yīng),。DHA是AsA的可逆的氧化型，在生物體內(nèi),，與抗壞血酸共同組成氧化還原系統(tǒng),，具有電子受體的作用。

測(cè)定原理：

DTT還原DHA生成AsA,，通過(guò)測(cè)定體系中AsA的生成速率,，即可計(jì)算出DHA含量。

自備儀器和用品：

低溫離心機(jī),、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀,、微量石英比色皿/96孔板（UV板）、可調(diào)式移液器,、研缽,、冰和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體100 mL×1瓶,，室溫保存,。

試劑二：液體16mL×1瓶，室溫保存,。

試劑三：粉劑×1瓶,，4℃保存。臨用前加入5mL蒸餾水充分溶解,。

標(biāo)準(zhǔn)品：粉劑×1瓶,， 4℃保存。臨用前加入5.743 mL蒸餾水充分溶解,；吸取0.1 mL上述溶液,，加入0.9 mL蒸餾水，混勻,，即為100μmol/L DHA,。

樣品中DHA提取：

1.        組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織,，加入1mL試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿,。12000g,，4℃離心20min，取上清置冰上待測(cè),。

2. 細(xì)菌,、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w,，超聲3秒,，間隔7秒，總時(shí)間3min）,；12000g,，4℃離心10min，取上清液置于冰上待測(cè),。

3. 血清等液體：直接測(cè)定,。

DHA測(cè)定操作：

1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到265 nm,，蒸餾水調(diào)零,。

2. 試劑二在25℃水浴鍋中預(yù)熱30 min。

3. 標(biāo)準(zhǔn)管：依次在微量石英比色皿/96孔板加入20μL標(biāo)準(zhǔn)液,、160μL預(yù)熱的試劑二和20μL試劑三,，迅速混勻后于265nm比色，記錄10s和130s的吸光值A1和A2,，△A空白管=A2-A1,。

4. 測(cè)定管：依次在微量石英比色皿/96孔板加入20μL上清液,、160μL預(yù)熱的試劑二和20μL試劑三,，迅速混勻后于265nm比色，記錄10s和130s的吸光值A3和A4,，△A測(cè)定管=A4-A3,。

注意：標(biāo)準(zhǔn)管只需測(cè)定一次。

計(jì)算公式：

a.使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

(1). 按蛋白濃度計(jì)算

DHA(nmol/mg prot) =[C標(biāo)準(zhǔn)液×△A測(cè)定管÷△A標(biāo)準(zhǔn)管×V標(biāo)準(zhǔn)]÷（Cpr×V樣）

=100×△A測(cè)定管÷△A標(biāo)準(zhǔn)管÷Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算

DHA(nmol/g 鮮重) =[C標(biāo)準(zhǔn)液×△A測(cè)定管÷△A標(biāo)準(zhǔn)管×V標(biāo)準(zhǔn)]÷(W×V樣÷V樣總)

=100×△A測(cè)定管÷△A標(biāo)準(zhǔn)管÷W

(3). 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

DHA(nmol/10⁴ cell) =[C標(biāo)準(zhǔn)液×△A測(cè)定管÷△A標(biāo)準(zhǔn)管×V標(biāo)準(zhǔn)]÷(W×V樣÷V樣總)

=100×△A測(cè)定管÷△A標(biāo)準(zhǔn)管÷細(xì)胞數(shù)量

（4）按液體體積計(jì)算

DHA(nmol/mL) =[C標(biāo)準(zhǔn)液×△A測(cè)定管÷△A標(biāo)準(zhǔn)管×V標(biāo)準(zhǔn)]÷V樣

=100×△A測(cè)定管÷△A標(biāo)準(zhǔn)管

C標(biāo)準(zhǔn)液：100μmol/L,；V樣總：上清液總體積,，1.0 mL=1 ×10^-3 L；V標(biāo)準(zhǔn)：加入標(biāo)準(zhǔn)品體積,，0.02mL,；V樣：加入樣本體積，0.02mL,；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL；W：樣品質(zhì)量（g）,。

b.使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

(1). 按蛋白濃度計(jì)算

DHA(nmol/mg prot) =[C標(biāo)準(zhǔn)液×△A測(cè)定管÷△A標(biāo)準(zhǔn)管×V標(biāo)準(zhǔn)]÷（Cpr×V樣）

=100×△A測(cè)定管÷△A標(biāo)準(zhǔn)管÷Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算

DHA(nmol/g 鮮重) =[C標(biāo)準(zhǔn)液×△A測(cè)定管÷△A標(biāo)準(zhǔn)管×V標(biāo)準(zhǔn)]÷(W×V樣÷V樣總)

=100×△A測(cè)定管÷△A標(biāo)準(zhǔn)管÷W

(3). 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

DHA(nmol/10⁴ cell) =[C標(biāo)準(zhǔn)液×△A測(cè)定管÷△A標(biāo)準(zhǔn)管×V標(biāo)準(zhǔn)]÷(W×V樣÷V樣總)

=100×△A測(cè)定管÷△A標(biāo)準(zhǔn)管÷細(xì)胞數(shù)量

（4）按液體體積計(jì)算

DHA(nmol/mL) =[C標(biāo)準(zhǔn)液×△A測(cè)定管÷△A標(biāo)準(zhǔn)管×V標(biāo)準(zhǔn)]÷V樣

=100×△A測(cè)定管÷△A標(biāo)準(zhǔn)管

C標(biāo)準(zhǔn)液：100μmol/L,；V樣總：上清液總體積,，1.0 mL=1×10^-3 L；V標(biāo)準(zhǔn)：加入標(biāo)準(zhǔn)品體積,，0.02mL,；V樣：加入樣本體積，0.02mL,；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL；W：樣品質(zhì)量（g）,。

注意事項(xiàng)：

1.        臨用前配制的試劑未使用完的4℃保存,，3天內(nèi)使用完。

2.        Z低檢出限為10μmol/L,。

脫氫抗壞血酸（DHA）含量測(cè)定試劑盒僅供科研,！