皖儀科技離子色譜測定硫酸新霉素的含量
引言
硫酸新霉素是1949年從新霉素鏈霉菌的代謝產(chǎn)物中分離得到的混合物，含有A,、B,、C3個(gè)成分,，其中新霉素B和C為主要成分，新霉素A僅微量,。硫酸新霉素主要通過與細(xì)菌,、核糖體30S亞單位結(jié)合，抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成,，從而達(dá)到抑制細(xì)菌的效果,。然而新霉素全身用藥有顯著腎毒性和耳毒性，故僅限于口服或局部應(yīng)用,。因此主要用于治療皮膚感染性疾病,，新霉素口服極少吸收（大約在5％），在腸道內(nèi)濃度很高,，與其他抗生素混合口服可用于對腸道微生物群系的控制,，適合于手術(shù)前的腸道消毒等。
硫酸新霉素目前中國藥典中使用的是抗生素微生物檢定法,，該方法時(shí)間較長,，無法滿足大規(guī)模測試的需求，而在實(shí)際應(yīng)用過程中,，客戶需要對不同時(shí)段發(fā)酵液,，提取液，成品等進(jìn)行測試,，以判斷工藝及方法是否符合要求,。然而中國藥典中的方法的時(shí)效性和局限性無法滿足這一要求。
目前歐洲藥典主要采用離子色譜安培檢測法測試硫酸新霉素有效成分,，而我國離子色譜法并未納入到中國藥典檢測方法中,，基于此，皖儀科技開發(fā)了一種離子色譜測試方法檢測硫酸新霉素有效成分含量,，樣品前處理操作簡單,，測試準(zhǔn)確性高，重現(xiàn)性好,，不同組分間分離度良好,，并且20分鐘可以完成一次檢測，可以滿足客戶大規(guī)模測試的要求,，并且提高時(shí)效性,，測試結(jié)果一致性，減少人為及系統(tǒng)誤差,。
1 實(shí)驗(yàn)方法
1.1測試條件
儀器：IC6600系列離子色譜儀配置安培檢測器,，柱后衍生；
色譜柱：氨基糖苷類專用色譜柱（4.6 mm×150mm）,；
保護(hù)柱：氨基糖苷類專用保護(hù)柱（30 mm×4 mm）,；
柱溫：35℃,；
流速：主泵1.0ml/min；副泵0.5ml/min
進(jìn)樣量：25μL,；
檢測器：安培檢測器
1.2 使用試劑
淋洗液：量取20mL三氟乙酸和6mL濃度為500g/L的氫氧化鈉使用純水定容至1L容量瓶中,，超聲，抽濾,。
柱后堿液：量取40mL濃度為500g/L氫氧化鈉使用純水定容至1L,超聲,，抽濾。
標(biāo)樣：硫酸新霉素標(biāo)準(zhǔn)樣品樣品：硫酸新霉素成品樣品,，硫酸新霉素發(fā)酵液樣品注：
l 建議使用色譜級試劑,，若是試劑純度不夠會使基線不平穩(wěn)，使得部分雜質(zhì)無法檢出,。
l 對發(fā)酵液進(jìn)行測試時(shí),，因發(fā)酵液中含雜質(zhì)較多，需要進(jìn)行適當(dāng)稀釋,，若是濃度過高會使待測樣品中雜質(zhì)含量過高,，超出柱容量影響測試結(jié)果并且會損害色譜柱。
l 發(fā)酵液中因雜質(zhì)較多需要進(jìn)行前處理：離心,，過濾等,，以去除部分雜質(zhì)以達(dá)到最佳的檢測效果。若不進(jìn)行前處理可能會對色譜柱造成堵塞,，損害色譜柱壽命等情況,。
1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備
根據(jù)效價(jià)用純水稀釋標(biāo)準(zhǔn)樣品硫酸新霉素效價(jià)分別為：10ug/mg，20ug/mg,，40ug/mg,，60ug/mg，80ug/mg,，100ug/mg定容至100mL容量瓶中，即得,。
表1 標(biāo)準(zhǔn)系列曲線濃度梯度表
2 測試結(jié)果
2.1 硫酸新霉素線性測試結(jié)果
依次移取10ug/mg,、20ug/mg、40ug/mg,、60ug/mg,、80ug/mg、100ug/mg的系列標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,，按照1.1工作測試條件得到標(biāo)準(zhǔn)曲線線譜圖多點(diǎn)重疊圖如圖1,，硫酸新霉素在該色譜條件下線性相關(guān)系數(shù)R=0.9999，線性良好,。
圖1 硫酸新霉素梯度效價(jià)色譜圖表2 線性方程
2.2 硫酸新霉素樣品圖與標(biāo)準(zhǔn)品譜圖
在1.1的工作測試條件下條件下,，對經(jīng)過前處理的樣品與標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測,。標(biāo)準(zhǔn)品樣品圖譜如圖2，成品樣品如圖3,，發(fā)酵液樣品如圖4所示,，可見無論是標(biāo)準(zhǔn)品還是樣品圖譜中的目標(biāo)硫酸新霉素C、硫酸新霉素B離子峰形對稱,，分離度良好,，最終得到樣品中硫酸新霉素B、硫酸新霉素C的含量,。
圖2 標(biāo)準(zhǔn)品測試譜圖
圖3 成品樣品測試譜圖
圖4 發(fā)酵液樣品測試譜圖
2.3 硫酸新霉素重復(fù)性測試結(jié)果
硫酸新霉素效價(jià)100ug/mg標(biāo)連續(xù)6針重復(fù)圖譜重疊圖如下：測試結(jié)果：保留時(shí)間的RSD為0.051％~0.063％,，峰面積保留時(shí)間RSD為0.223％，重復(fù)性良好,，測試較為穩(wěn)定,。
圖5 重復(fù)性測試譜圖表3 重復(fù)性數(shù)據(jù)表
3 總結(jié)
本次采用皖儀科技離子色譜儀IC6600系列對硫酸新霉素樣品進(jìn)行系統(tǒng)適用性、標(biāo)準(zhǔn)曲線驗(yàn)證,、重復(fù)性驗(yàn)證,。測試結(jié)果峰形較好，線性良好,，重復(fù)性滿足要求,，靈敏度高完全滿足測試要求。
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