細(xì)胞測試分析系統(tǒng)

細(xì)胞測試分析系統(tǒng)       流式單細(xì)胞力學(xué)儀

德國Zellmechanik公司

AcCellerator型

單細(xì)胞力學(xué)流式分析系統(tǒng)

研發(fā)背景

1 研究細(xì)胞力學(xué)在臨床有什么意義,？ 如何區(qū)分不同果實的成熟度,？

解決方案：施加適當(dāng)?shù)牧Σ⒏袘?yīng)水果的機(jī)械特性，將清楚地向您展示成熟和過熟的獼猴桃之間的區(qū)別,。

這是否也適用于較小的水果組織碎片,？如果我們下降到單細(xì)胞水平怎么辦？

細(xì)胞的機(jī)械特性由功能上重要的細(xì)胞成分控制,，例如細(xì)胞骨架,。它們構(gòu)成了一種新興的無標(biāo)記生物標(biāo)志物，可以直接了解細(xì)胞功能或功能障礙,。因此,，機(jī)械特性有助于理解和評估藥物治療效果、免疫細(xì)胞活化、干細(xì)胞分化,、癌癥預(yù)后或培養(yǎng)細(xì)胞的狀態(tài)和質(zhì)量的評估,。

   細(xì)胞變形能力與細(xì)胞的狀況和功能相關(guān)。

   無需標(biāo)記即可評估細(xì)胞變形能力,。

   應(yīng)用潛力巨大,。

細(xì)胞力學(xué)構(gòu)成了研究從發(fā)育到疾病的主題的關(guān)鍵科學(xué)目標(biāo)。

2 為什么采用單細(xì)胞流式分析,？

Jochen Guck 教授在德累斯頓工業(yè)大學(xué)使用 AFM 和光學(xué)拉伸來揭示細(xì)胞力學(xué)與細(xì)胞功能（或功能障礙）之間的相關(guān)性,。這些方法的一個主要障礙是低通量（多 100 個細(xì)胞/小時）。測量過程為：找到一個細(xì)胞,，停止施力,，整個實驗結(jié)束后釋放細(xì)胞，分析測量參數(shù),。為了克服耗時的步驟,，于是他們開發(fā)了一種使用具有連續(xù)力和動態(tài)分析的連續(xù)流的方法：RT-DC。

Oliver Otto 博士和 Philipp Rosendahl 博士在 2013 年左右實施了這個想法,。從那時起,，已經(jīng)發(fā)表了許多具有高影響力的科學(xué)論文，并且技術(shù)開始普及,。

現(xiàn)在可以同時測量細(xì)胞的物理特性和熒光信號 (RT-FDC),，從而可以將細(xì)胞的物理特性與細(xì)胞生物學(xué)的黃金標(biāo)準(zhǔn)（熒光流式細(xì)胞術(shù)）進(jìn)行比較和關(guān)聯(lián)。近還可以沿通道動態(tài)跟蹤細(xì)胞變形并研究變形的時間相關(guān)動力學(xué) (dRT-DC),。

技術(shù)原理

1 如何高速的壓縮單個細(xì)胞,？

為了產(chǎn)生確定的力，孤立的細(xì)胞被泵送通過橫截面略大于細(xì)胞橫截面的微通道,。周圍流體的壓力梯度產(chǎn)生流動剖面并使細(xì)胞流體動力學(xué)變形,。流體的流速和粘度控制作用在細(xì)胞上的力。

細(xì)胞可以通過流體動力變形,。

力由流速和粘度控制,。

較軟的細(xì)胞顯示較大的變形。

RT-DC 中的“實時"來自于拍攝圖像時對細(xì)胞輪廓的即時分析,。

細(xì)胞面積,、高度、寬度,、縱橫比等的立即計算允許對數(shù)據(jù)進(jìn)行即時觀察和選通,。

該算法還計算細(xì)胞的亮度和亮度偏差等參數(shù)，從而深入了解形態(tài)學(xué)特性,。

系統(tǒng)保存每個檢測到的事件圖像,，可以輕松查看異常值是碎片還是您正在尋找的稀有細(xì)胞,。

3 如何表征力進(jìn)而計算楊氏模量？

以下未發(fā)布素材

肌動蛋白應(yīng)力纖維組織促進(jìn)浸潤前乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞硬化和增殖

乳腺癌是女性死亡的主要原因,。乳腺癌進(jìn)展的多步驟過程源于癌基因和腫瘤抑制基因的遺傳和表觀遺傳改變,，這些改變賦予乳腺細(xì)胞生長和/或生存優(yōu)勢。隨后的分子改變可能會將這些癌前細(xì)胞轉(zhuǎn)化為惡性細(xì)胞,，具有侵襲和轉(zhuǎn)移能力,。

病毒非受體酪氨酸激酶 v-Src 及其細(xì)胞同源物 c-Src 是研究多的原癌基因，涉及腫瘤發(fā)展的許多方面,，包括增殖,、存活、粘附,、遷移,、侵襲和轉(zhuǎn)移。Src 蛋白水平,，在更大程度上，Src 蛋白激酶活性在惡性和非惡性乳腺組織中經(jīng)常升高,，并且與乳腺癌患者的存活率降低顯著相關(guān),。

Src 主要通過降低粘附性和調(diào)節(jié)肌動蛋白細(xì)胞骨架3來誘導(dǎo)腫瘤轉(zhuǎn)移。由單體肌動蛋白亞基 (G-actin) 組裝而成的絲狀肌動蛋白 (F-actin) 的半柔性聚合物施加或抵抗力以驅(qū)動大量細(xì)胞過程,，包括細(xì)胞形狀,、細(xì)胞移動性、胞質(zhì)分裂的變化和細(xì)胞內(nèi)運輸,。此外,，肌動蛋白絲將外力轉(zhuǎn)化為指導(dǎo)細(xì)胞反應(yīng)的生化信號事件。這主要在腫瘤侵襲和惡性腫瘤的背景下進(jìn)行了研究,，其中來自腫瘤微環(huán)境的機(jī)械信號會影響轉(zhuǎn)移級聯(lián). 反過來,，轉(zhuǎn)移性乳腺細(xì)胞的硬度低于健康細(xì)胞，這在很大程度上取決于細(xì)胞骨架,。為了執(zhí)行這些不同的功能,，肌動蛋白絲通過控制在物種之間高度保守的大量肌動蛋白結(jié)合蛋白 (ABP) 組織成不同的結(jié)構(gòu). Ena/VASP（啟用/血管擴(kuò)張劑刺激的磷蛋白）家族蛋白，包括蛋白質(zhì)啟用的同源物 (Mena),、血管擴(kuò)張劑刺激的磷蛋白 (VASP) 和 Ena-VASP 樣 (EVL),，與肌動蛋白絲的倒刺末端相關(guān)。它們似乎對 F-肌動蛋白有不同的影響,，包括通過其抗加帽活性促進(jìn)肌動蛋白絲伸長,、抑制分支肌動蛋白網(wǎng)絡(luò)的形成和促進(jìn) F-肌動蛋白捆綁。因此,，Ena/VASP 家族成員對癌細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)移具有不同的影響,。雖然 EVL 抑制細(xì)胞遷移,，但 Mena 變體 Mena (INV) 驅(qū)動侵襲、血管內(nèi)滲透和轉(zhuǎn)移. 其他 ABP 抑制肌動蛋白聚合或穩(wěn)定肌動蛋白絲,。此外,，一些 ABP 將肌動蛋白絲組織成更高階的網(wǎng)絡(luò)，通過交聯(lián)肌動蛋白絲,，或使用 F-肌動蛋白作為支架,、物理支撐或軌道，以促進(jìn)收縮性并產(chǎn)生張力,。

我們以前曾報道過 Src 的促生長功能是由果蠅上皮細(xì)胞中的肌動蛋白細(xì)胞骨架控制的,。在本報告中，我們研究了 F-肌動蛋白在支持 Src 下游癌癥前體擴(kuò)張中的作用,。使用具有條件 Src 誘導(dǎo)的乳腺細(xì)胞系,，我們證明在細(xì)胞獲得惡性特征之前，它們會經(jīng)歷短暫的應(yīng)力纖維依賴性硬化狀態(tài),，導(dǎo)致細(xì)胞增殖和向*轉(zhuǎn)化狀態(tài)的進(jìn)展,。

骨髓生態(tài)位模擬物通過整合素信號調(diào)節(jié) HSPC 功能

造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞 (HSPC) 錨定在骨髓 (BM) 中稱為造血生態(tài)位的特殊微環(huán)境中。這些細(xì)胞由它們的自我更新能力和產(chǎn)生所有成熟血細(xì)胞的能力來定義,。在臨床或組織工程使用之前,，人類 HSPCs 可以通過表面抗原 CD34 進(jìn)行富集。由于這些細(xì)胞在大多數(shù)移植來源中占少數(shù),，并且適用細(xì)胞的數(shù)量有限,，因此已使用細(xì)胞因子雞尾酒或小分子建立離體擴(kuò)增培養(yǎng)物. 然而， HSPCs 在懸浮液中的體外培養(yǎng)會導(dǎo)致異質(zhì)細(xì)胞群具有未定義的細(xì)胞身份,。

在 BM 生態(tài)位中,，HSPCs 不僅由細(xì)胞因子維持，而且由細(xì)胞-基質(zhì)粘附初步維持,，通過粘附受體介導(dǎo),，例如整合素 (ITG)。在這方面,，發(fā)現(xiàn) β1 (CD29) 和 β2 ITGs 促進(jìn) HSPCs 與間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞 (MSCs) 的初始接觸并且 β3 (CD61) 表達(dá)被證明是體內(nèi) 長期再增殖 HSPCs 的標(biāo)志物. 因此,，使用 HSPC 和 MSC 等生態(tài)位細(xì)胞的共培養(yǎng)離體重塑 BM 生態(tài)位逐漸成為人們關(guān)注的焦點，并被證明是干細(xì)胞擴(kuò)增的有前途的工具. 然而,，在臨床或研究應(yīng)用中,，兩個細(xì)胞群的直接接觸需要 HSPC 培養(yǎng)后純化。

為了解決這些問題,，我們使用了一種在體外重塑BM細(xì)胞外基質(zhì)的新型培養(yǎng)方法,，即從永生化間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞（SCP-1）衍生的脫細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）支架。這種支架被發(fā)現(xiàn)具有高度可重復(fù)性,，并提供超過 500 種蛋白質(zhì),，包括主要的生態(tài)位蛋白,，如膠原蛋白、纖連蛋白,、糖胺聚糖以及骨橋蛋白和信號分子,，如基質(zhì)衍生因子 1 (SDF-1)。因此,，提供了存在于BM壁龕中的粘合面和物理提示,。發(fā)現(xiàn)周圍環(huán)境的生物力學(xué)力通過整合素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞，并在體外被證明可以控制 HSPC 的命運,。 _ _ _ _ 這些物理方面被證明是分化的標(biāo)志并驅(qū)動細(xì)胞命運決定,。然而，HSPC 與 BM 基質(zhì)相互作用的詳細(xì)機(jī)制僅關(guān)于細(xì)胞外環(huán)境的了解較少,。

通過培養(yǎng)從粒細(xì)胞集落刺激因子 (G-CSF) 動員的健康供體的外周血 (PB) 中分離的人 CD34 +細(xì)胞,，在去細(xì)胞 ECM 制劑上使用低濃度的細(xì)胞因子，我們可以分離兩種細(xì)胞部分：貼壁 (AT) 和上清液,。 SN) 細(xì)胞,，類似于與 MSC 的 HSPC 共培養(yǎng)物。使用實時變形細(xì)胞儀 (RT-DC)為了揭示塑料培養(yǎng)皿 (PCD) 中新鮮分離的 SN,、AT 和經(jīng)典懸浮培養(yǎng)的 HSPCs 的生物力學(xué)表型,，我們發(fā)現(xiàn)新鮮分離的細(xì)胞與培養(yǎng)細(xì)胞相比是同質(zhì)的可變形細(xì)胞和小細(xì)胞。與 PCD 培養(yǎng)或 SN 細(xì)胞相比,，AT 細(xì)胞顯示肌動蛋白聚合到應(yīng)力纖維、強烈的遷移行為和不易變形的表型,。發(fā)現(xiàn) SDF-1 通過 CXC 趨化因子受體 4 型 (CXCR4) 被 AT 細(xì)胞主動識別和內(nèi)化,。此外，CXCR4 被認(rèn)為在 AT 細(xì)胞中偏向 ECM 蛋白,。重要的是,，我們發(fā)現(xiàn)在 AT 細(xì)胞上誘導(dǎo) ITGαIIb、ITGαV 和 ITGβ3 的表面表達(dá),，并且可以證實 ITGαvβ3 在 HSPC-ECM 相互作用中在粘附和遷移方面的重要作用,。