單細胞測試分析系統(tǒng)

單細胞測試分析系統(tǒng)      流式單細胞力學儀器

德國Zellmechanik公司

AcCellerator型

單細胞力學流式分析系統(tǒng)

研發(fā)背景

1 研究細胞力學在臨床有什么意義？ 如何區(qū)分不同果實的成熟度,？

解決方案：施加適當的力并感應水果的機械特性,，將清楚地向您展示成熟和過熟的獼猴桃之間的區(qū)別。

這是否也適用于較小的水果組織碎片,？如果我們下降到單細胞水平怎么辦,？

細胞的機械特性由功能上重要的細胞成分控制，例如細胞骨架,。它們構成了一種新興的無標記生物標志物,，可以直接了解細胞功能或功能障礙。因此,，機械特性有助于理解和評估藥物治療效果,、免疫細胞活化、干細胞分化,、癌癥預后或培養(yǎng)細胞的狀態(tài)和質量的評估,。

   細胞變形能力與細胞的狀況和功能相關。

   無需標記即可評估細胞變形能力,。

   應用潛力巨大,。

細胞力學構成了研究從發(fā)育到疾病的主題的關鍵科學目標。

2 為什么采用單細胞流式分析,？

Jochen Guck 教授在德累斯頓工業(yè)大學使用 AFM 和光學拉伸來揭示細胞力學與細胞功能（或功能障礙）之間的相關性,。這些方法的一個主要障礙是低通量（多 100 個細胞/小時）。測量過程為：找到一個細胞,，停止施力,，整個實驗結束后釋放細胞，分析測量參數,。為了克服耗時的步驟,，于是他們開發(fā)了一種使用具有連續(xù)力和動態(tài)分析的連續(xù)流的方法：RT-DC。

Oliver Otto 博士和 Philipp Rosendahl 博士在 2013 年左右實施了這個想法,。從那時起,，已經發(fā)表了許多具有高影響力的科學論文，并且技術開始普及,。

現在可以同時測量細胞的物理特性和熒光信號 (RT-FDC),，從而可以將細胞的物理特性與細胞生物學的黃金標準（熒光流式細胞術）進行比較和關聯,。近還可以沿通道動態(tài)跟蹤細胞變形并研究變形的時間相關動力學 (dRT-DC)。

技術原理

1 如何高速的壓縮單個細胞,？

為了產生確定的力,，孤立的細胞被泵送通過橫截面略大于細胞橫截面的微通道。周圍流體的壓力梯度產生流動剖面并使細胞流體動力學變形,。流體的流速和粘度控制作用在細胞上的力,。

細胞可以通過流體動力變形。

力由流速和粘度控制,。

較軟的細胞顯示較大的變形,。

RT-DC 中的“實時"來自于拍攝圖像時對細胞輪廓的即時分析。

細胞面積,、高度,、寬度、縱橫比等的立即計算允許對數據進行即時觀察和選通,。

該算法還計算細胞的亮度和亮度偏差等參數,，從而深入了解形態(tài)學特性。

系統(tǒng)保存每個檢測到的事件圖像,，可以輕松查看異常值是碎片還是您正在尋找的稀有細胞,。

3 如何表征力進而計算楊氏模量？

用于高通量細胞變形測量的微流體方法的比較

細胞的機械表型是其狀態(tài)和功能的固有生物物理標記,，在基礎和應用生物學研究中有許多應用,。基于微流體的方法使單細胞機械表型分析的吞吐量可與流式細胞術相媲美,。在這里,，我們提出了一項標準化的跨實驗室研究，比較了三種基于微流體的測量細胞機械表型的方法：基于收縮的變形細胞術 (cDC),、剪切流變形細胞術 (sDC) 和拉伸流變形細胞術 (xDC)。所有三種方法都檢測由暴露于改變的滲透壓引起的細胞變形性變化,。然而,，僅在 cDC 和 sDC 中檢測到 latrunculin B 誘導的肌動蛋白分解后的劑量依賴性變形能力增加，這表明當將細胞暴露于 xDC 施加的更高應變率時,，肌動蛋白細胞骨架以外的細胞成分主導反應,。這里提出的直接比較進一步加深了我們對不同變形性細胞術方法的適用性的理解，并為解釋使用不同平臺執(zhí)行的變形性測量提供了背景,。

實時變形細胞儀：動態(tài)細胞機械表型分析

我們引入了實時變形細胞儀 (RT-DC),，用于對大量細胞（>100,000 個細胞）進行連續(xù)細胞力學表征，分析速率大于 100 個細胞/秒,。RT-DC 對細胞骨架的改變很敏感,，可以區(qū)分細胞周期階段,，跟蹤干細胞分化成不同的譜系，并通過其機械指紋識別全血中的細胞群,。該技術為流式細胞術增加了一個新的無標記維度,，在生物學、生物技術和醫(yī)學中具有多種應用,。

對干細胞衍生紅細胞的機械特性進行高通量評估,，以進行細胞下游加工

每年，在 176 個國家的 13000 多個血液中心收集了大約 1.125 億次獻血,。然而,，世界衛(wèi)生組織每年都會報告供輸血使用的安全獻血短缺，這主要是由于有資格獻血的人數減少以及血液長期儲存的技術限制,。因此,，迫切需要易于管理的紅細胞 (RBC) 替代來源，其中一種選擇是用干細胞制造它們,。Giarratana等人在 2011 年將人造紅細胞 (mRBC) 積極驗證為潛在的臨床產品,。已經使用胚胎干細胞在體外產生了潛在的可輸血紅細胞，誘導多能干細胞,，來自骨髓或臍帶血的 CD34+ 細胞,，以及近一種永生化的成人紅細胞系（布里斯托紅系成人 BEL-A ) . 然而，目前使用的差異化協議并不是 100% 有效的,。具體來說,，該協議的終產品是一種異質細胞混合物，不僅包含功能齊全的去核 mRBC,，還包含在去核過程中排出的自由浮動核和未分化的有核細胞,。殘留的干細胞、部分分化的細胞和細胞核的存在,，如果注射到患者體內會帶來健康風險,，因此對于 mRBC 和其他細胞療法而言，必須通過開發(fā)適當的純化程序來緩解這一嚴重問題. 傳統(tǒng)上,，靶細胞分離是通過熒光激活細胞分選 (FACS) 和磁激活細胞分選 (MACS) 進行的,。這兩種技術都非常具體，因為它們利用分子生物標志物,，但需要添加昂貴的修飾劑,，如抗體或 DNA 染色劑，以及單獨的質量控制過程,。此外,，這些技術的通量是有限的（例如，本研究中使用的 FACS 儀器每小時10⁷ 個細胞）,，工業(yè)上可行的技術需要具有成本效益,、自動化和可擴展的方法. 文獻中提出了各種無標記方法,，但尚未達到商業(yè)測試階段：聲泳、磁泳,、光學方和被動分選,。被動分選（例如慣性聚焦、夾流分級,、確定性橫向位移和過濾）利用了設備設計的特性,，并且除了液體泵送系統(tǒng)之外，它們不需要任何其他外力,。這些系統(tǒng)具有許多潛在優(yōu)勢,，例如減少樣品處理步驟的數量（例如. 通過減少染色/洗滌步驟），相對高的通量和效率（> 90%）,。然而,，在這種類型的系統(tǒng)中，分類純粹是由內源性細胞特性（如大小和可變形性）促進的,，需要進一步的證據來量化細胞機械類型,，以克服目前缺乏對例如 mRBC 機械特性34的知識，并確定潛在的基于機械型的分類,。變形性正在成為一種新的同質性標記,，可用于識別復雜細胞樣本中的亞群，例如 mRBC. 然而,，雖然定性觀察已經注意到整個 CD34+ 細胞分化方案中的表型變化,，但對其機械表型變化知之甚少。本文報告了對這些變化的次廣泛的定量分析,，結合了高通量微流體和傳統(tǒng)的生物物理表征,。具體來說，我們次表征了臍帶血 CD34+在體外進行的機械分型分化為紅細胞,，重點關注四個關鍵階段,。收集的數據使用實時變形細胞儀 (RT-DC)、原子力顯微鏡 (AFM) 和明場/熒光成像來確定去核細胞,、有核細胞和自由浮動細胞核的大小和可變形性,。此外，對細胞核和細胞骨架蛋白進行染色,，以研究這些因素對觀察到的機械典型變化的潛在貢獻。