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PolyShooterTM
NEO-PEI Transfection Reagent
DNA transfection reagent for large scale recombinant protein expression and virus production
Catalog Number:P09310
01/產(chǎn)品概述
PEI是基因轉(zhuǎn)染中常用的高分子載體,,同時(shí)也是基因轉(zhuǎn)染的“金標(biāo)準(zhǔn)"。PEI轉(zhuǎn)染的原理是帶正電的陽離子聚合物與核酸中帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)形成帶正電的復(fù)合物后,,再與細(xì)胞表面帶負(fù)電的蛋白多糖相互作用,通過細(xì)胞胞吞進(jìn)入細(xì)胞,。PEI主鏈上每三個(gè)原子就含有一個(gè)氮原子,,因此具有較高的陽離子密度,這對(duì)于結(jié)合帶負(fù)電荷的核酸分子是非常有利的,。在生理pH條件下,,PEI部分胺基被質(zhì)子化,,隨著體系pH值的降低,PEI剩余的胺基被質(zhì)子化,,從而賦予了其出色的核酸結(jié)合能力和質(zhì)子緩沖能力,,有利于通過質(zhì)子海綿效應(yīng)從內(nèi)涵體逃逸,。但是,PEI高的陽離子電荷密度,,導(dǎo)致其嚴(yán)重的細(xì)胞毒性,。同時(shí),PEI 25K含有4%-11%的殘留丙?;@可能阻礙聚合物主鏈與DNA的有效結(jié)合,,影響基因轉(zhuǎn)染效率,。因此,,針對(duì)PEI的研究工作主要聚焦在通過功能化修飾以及脫丙酰基,,來提高轉(zhuǎn)染效率,、降低細(xì)胞毒性,。
LeapWal PolyShooter NEO-PEI DNA 轉(zhuǎn)染試劑是一種基于分子量25 kDa PEI的DNA轉(zhuǎn)染試劑。通過對(duì)PEI進(jìn)行功能改性,,NEO-PEI 丙?;?脫落,顯著改善了PEI的基因遞送性能,,表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性和較低的細(xì)胞毒性,。PolyShooter NEO-PEI與PEI 25000轉(zhuǎn)染試劑相比,,具有很多優(yōu)點(diǎn)。包括:
1. PolyShooter NEO-PEI為即用型轉(zhuǎn)染試劑,,無需配置,可直接用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn),,而PEI 25000需要先把水調(diào)成弱酸性助其溶解,,溶解后再用NaOH把pH調(diào)至中性,配置過程繁瑣復(fù)雜,,容易引入誤差導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效果不穩(wěn)定。PEI 40000雖然較PEI 25000更易溶解,,但也同樣存在配置繁瑣,,配置過程中容易引入誤差的風(fēng)險(xiǎn)。
2. PEI 25000含有4%-11%的丙?;鶜埩簦,;鶗?huì)阻止聚合物主鏈與DNA結(jié)合,,影響轉(zhuǎn)染效果。相較于PEI 25000,,PolyShooter NEO-PEI丙酰基*脫落,,因此其性能始終高效如一,。
LeapWal PolyShooter NEO-PEI DNA 轉(zhuǎn)染試劑是一種功能強(qiáng)大、值得信賴且經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染試劑,,廣泛適用于多種細(xì)胞系,包括HEK-293,、HEK-293T,、CHO-K1、COS-1,、COS-7、NIH/3T3,、Sf9,、HepG2和HeLa細(xì)胞等。同時(shí),PolyShooter NEO-PEI轉(zhuǎn)染試劑在大規(guī)模重組蛋白表達(dá)和病毒生產(chǎn)等領(lǐng)域有著高效,、低毒、穩(wěn)定,、可靠等顯著優(yōu)勢(shì),。PolyShooter NEO-PEI提供從96孔板到200L生物反應(yīng)器持續(xù)的高表達(dá)轉(zhuǎn)染體系,,實(shí)現(xiàn)從新藥研發(fā)到工業(yè)化生產(chǎn)的輕松過度。與大多數(shù)細(xì)胞轉(zhuǎn)染方案相比,,使用PolyShooter NEO-PEI既能得到穩(wěn)定的基因表達(dá)效率,,又可顯著降低轉(zhuǎn)染成本,。
02/產(chǎn)品組分
03/保存條件
冰袋(wet ice)運(yùn)輸。4℃保存,,有效期6個(gè)月。-30℃至-10℃保存,,有效期12個(gè)月,,避免反復(fù)凍融。
04/產(chǎn)品特點(diǎn)
v 易于使用——即用型轉(zhuǎn)染試劑,,無需配置,可直接用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)
v 轉(zhuǎn)染效率高——針對(duì)多種類型細(xì)胞,,均表現(xiàn)出優(yōu)秀的轉(zhuǎn)染效率和高重組蛋白表達(dá)
v 細(xì)胞毒性低——作用溫和,,能更好地實(shí)現(xiàn)高轉(zhuǎn)染效率與低細(xì)胞毒性之間的平衡
v 性能更穩(wěn)定——丙?;?脫落,性能始終高效如一
v 高性價(jià)比——既能得到穩(wěn)定的基因表達(dá)效率,,又可顯著降低轉(zhuǎn)染成本
v 化學(xué)成分明確,,不含動(dòng)物來源成分
05/適用范圍
PolyShooter NEO-PEI Transfection Reagent廣泛適用于多種細(xì)胞系的DNA轉(zhuǎn)染,可應(yīng)用于大規(guī)模重組蛋白表達(dá)和病毒生產(chǎn)等領(lǐng)域,。本試劑提供從96孔板到200L生物反應(yīng)器持續(xù)的高表達(dá)轉(zhuǎn)染體系,實(shí)現(xiàn)從新藥研發(fā)到工業(yè)化生產(chǎn)的輕松過度,。
06/實(shí)驗(yàn)流程概要
圖1: PolyShooter NEO-PEI Transfection Reagent轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)流程圖
07/實(shí)驗(yàn)步驟(以24孔板為例,,其他培養(yǎng)板加樣體積參考表一:轉(zhuǎn)染量度標(biāo)準(zhǔn))
1: 準(zhǔn)備待轉(zhuǎn)染細(xì)胞
貼壁細(xì)胞:轉(zhuǎn)染前一天,將消化后的細(xì)胞按照每孔0.3-2x105個(gè)細(xì)胞的量進(jìn)行鋪板,,使其在轉(zhuǎn)染時(shí)密度為60%-70%,。
懸浮細(xì)胞:轉(zhuǎn)染當(dāng)天,,配制轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物之前,,在24孔板中進(jìn)行細(xì)胞鋪板,每500 µL生長(zhǎng)培養(yǎng)基中加入2-5x105個(gè)細(xì)胞,。
? 細(xì)胞狀態(tài)會(huì)極大影響轉(zhuǎn)染效率,,待轉(zhuǎn)染細(xì)胞應(yīng)處于良好生長(zhǎng)狀態(tài),建議使用生長(zhǎng)處于指數(shù)期,、存活率大于90% 的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染,。
2: 準(zhǔn)備PolyShooter NEO-PEI轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物
(1)取1 μg質(zhì)粒加入到1.5 mL離心管中,,加入2.5 μL* PolyShooter NEO-PEI轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)粒混合,,室溫孵育3分鐘,。
? * PolyShooter NEO-PEI轉(zhuǎn)染試劑使用量受細(xì)胞類型及其他實(shí)驗(yàn)條件影響,通常情況下,,DNA(μg)和PolyShooter NEO-PEI轉(zhuǎn)染試劑(μL)的推薦使用比例為1:2.5,。建議初次使用時(shí),,可在1:1-1:5的范圍內(nèi)調(diào)整以優(yōu)化轉(zhuǎn)染效果。
(2)往上述混合物中加入100 μL無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基1(與培養(yǎng)體系一致,,且無血清無雙抗),,輕輕混勻,在室溫下靜置30分鐘,,形成轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物。
? PolyShooter NEO-PEI轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物在室溫下4個(gè)小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定,。
(3)30分鐘后,,往轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物中加入150 μL無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基2(與培養(yǎng)體系一致,,且無血清無雙抗)稀釋復(fù)合物。
3: 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
棄去細(xì)胞培養(yǎng)基,將上述250 µL轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物加入每孔細(xì)胞,,轉(zhuǎn)染4-16小時(shí)后,,給細(xì)胞補(bǔ)充新鮮生長(zhǎng)培養(yǎng)基500 µL/孔,。
4: 分析轉(zhuǎn)染細(xì)胞
轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)36-48小時(shí)后,可根據(jù)實(shí)際情況用熒光檢測(cè)法,、Western Blot,、RT-PCR,、ELISA、流式細(xì)胞術(shù),、報(bào)告基因等檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果,,或加入篩選藥物進(jìn)行穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選。
表一:轉(zhuǎn)染量度標(biāo)準(zhǔn)
08/注意事項(xiàng)
1: 核酸質(zhì)量:想要獲得最高的轉(zhuǎn)染效率和更低的細(xì)胞毒性,,應(yīng)選用高純度、無菌,、無污染、無內(nèi)毒素的優(yōu)質(zhì)核酸,。質(zhì)粒中的內(nèi)毒素是轉(zhuǎn)染的大敵,,內(nèi)毒素會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率顯著下降。推薦使用無內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取,,保證質(zhì)粒A260/A280比值為1.8-2.0。同時(shí),,需合理計(jì)算質(zhì)粒用量,,轉(zhuǎn)染過量的質(zhì)粒可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞毒性甚至死亡,;
2: 細(xì)胞質(zhì)量:細(xì)胞狀態(tài)會(huì)極大影響轉(zhuǎn)染效率,建議使用生長(zhǎng)處于指數(shù)期,、存活率大于90%的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染,;
3: 細(xì)胞密度:建議細(xì)胞傳代后12-24 h內(nèi)、細(xì)胞密度為60%-70% 時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染,。不同的細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn),,對(duì)細(xì)胞密度的要求不盡相同。在進(jìn)行不同核酸或不同細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染時(shí),,需要根據(jù)說明書再次優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件。此外,,在實(shí)驗(yàn)過程中保證相同的接種條件,,確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可重復(fù)性;
4: 質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑使用比例:對(duì)于大多數(shù)細(xì)胞系,,轉(zhuǎn)染復(fù)合物中DNA (μg)與PolyShoote NEO-PEI Transfection Reagent (μL) 的比例在1:1至1:5之間,推薦比例為1:2.5,。想要獲得*的轉(zhuǎn)染結(jié)果,需要對(duì)這一比例進(jìn)行優(yōu)化,,根據(jù)所轉(zhuǎn)染細(xì)胞及質(zhì)粒選擇適合的轉(zhuǎn)染比例,;
5: PolyShooter NEO-PEI Transfection Reagent也可用于有血清培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)染,,但通過我們實(shí)驗(yàn)室的測(cè)試,,我們認(rèn)為體系中血清的存在會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)染效果有一定程度的干擾,,所以,為了追求更高效的轉(zhuǎn)染效率,,我們更推薦使用無血清轉(zhuǎn)染法(即“07/實(shí)驗(yàn)步驟"中敘述的轉(zhuǎn)染方法),;
6: 由于一些特殊培養(yǎng)基中的某些成分可能會(huì)抑制陽離子聚合物介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染,因此有必要檢測(cè)特殊培養(yǎng)基與PolyShooter NEO-PEI Transfection Reagent的相容性,;
7: 為了您的健康安全,,請(qǐng)規(guī)范操作,,穿戴實(shí)驗(yàn)服與手套開展實(shí)驗(yàn),;
8: 本產(chǎn)品僅供科研使用,,請(qǐng)勿用于臨床診斷及治療。
09/實(shí)驗(yàn)案例分析
1: 轉(zhuǎn)染前一天,,將圖2所示3種狀態(tài)良好的細(xì)胞接種于24孔板,,使其在轉(zhuǎn)染時(shí)密度為60%-70%。
2: 按照每孔計(jì)量,,取1μg GFP質(zhì)粒加入到1.5 mL離心管中,,PolyShooter NEO-PEI組(圖2上)加入2.5 μL PolyShooter NEO-PEI Transfection Reagent與質(zhì)粒混合,,PEI組(圖2下)加入2.5 μL PEI 25k與質(zhì)?;旌稀J覝胤跤?分鐘后,,往混合物中加入100 μL無血清基礎(chǔ)DMEM培養(yǎng)基,輕輕混勻,,在室溫下靜置30分鐘,,形成轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物。
3: 孵育30分鐘后,,往轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物中加入150 μL無血清基礎(chǔ)DMEM培養(yǎng)基稀釋復(fù)合物。
4: 將細(xì)胞培養(yǎng)基棄去,,加入上述250 µL 轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物,。
5: 轉(zhuǎn)染12小時(shí)后,給細(xì)胞補(bǔ)充新鮮生長(zhǎng)培養(yǎng)基500 µL/孔,。
6: 轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后,用熒光顯微鏡檢測(cè)GFP綠色熒光蛋白表達(dá)情況,,并拍照記錄,,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。
圖2: 轉(zhuǎn)染細(xì)胞48小時(shí)后,,用熒光顯微鏡檢測(cè)GFP綠色熒光蛋白表達(dá)情況
10/其他相關(guān)產(chǎn)品
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