ViralStars^TM LP

Lentivirus Packaging Kit

Catalog Number：LP110

01/產(chǎn)品概述

慢病毒是一種有包膜的RNA病毒，直徑為80-120 nm,，呈二十面體對(duì)稱結(jié)構(gòu),、球形,。病毒顆粒最外層是包膜（包膜蛋白決定了感染細(xì)胞的類型）,，再往里依次為基質(zhì)蛋白和衣殼,，最里面是兩條相同的正股RNA鏈和酶（逆轉(zhuǎn)錄酶,、整合酶和蛋白酶）,。

慢病毒表達(dá)載體包含了包裝、轉(zhuǎn)染,、穩(wěn)定整合所需要的遺傳信息,。慢病毒包裝質(zhì)粒可提供包裝重組慢病毒載體所需的所有輔助蛋白,。為產(chǎn)生高滴度的病毒顆粒,，需要利用表達(dá)載體和包裝質(zhì)粒同時(shí)共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在細(xì)胞中進(jìn)行病毒包裝,，包裝好的假病毒顆粒分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中,，離心取得上清液后，可以直接或濃縮后用于宿主細(xì)胞的感染,。

慢病毒感染細(xì)胞的第一步是通過包膜蛋白與細(xì)胞表面受體結(jié)合,。慢病毒與宿主細(xì)胞膜融合后釋放結(jié)構(gòu)蛋白、酶蛋白和病毒核心,。病毒RNA在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下逆轉(zhuǎn)錄并與整合酶形成整合前復(fù)合物,。整合前復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核后，整合酶催化其整合至宿主基因組,。整合后的DNA轉(zhuǎn)錄為mRNA,，回到細(xì)胞漿中，表達(dá)目的蛋白或產(chǎn)生RNAi干擾,。

ViralStars LP Lentivirus Packaging Kit慢病毒包裝試劑盒屬于第二代慢病毒包裝體系,，同時(shí)可兼容第二代和第三代慢病毒包裝質(zhì)粒,。慢病毒中的毒性基因已經(jīng)被剔除并被外源性目的基因所取代，屬于假型病毒,，即產(chǎn)生的慢病毒感染目的細(xì)胞后不會(huì)再感染其他細(xì)胞,，也不會(huì)利用宿主細(xì)胞產(chǎn)生新的病毒顆粒。ViralStars LP Lentivirus Packaging Kit包裝的慢病毒具有感染效率高,、感染譜廣等特點(diǎn),，可實(shí)現(xiàn)外源基因在宿主細(xì)胞中的穩(wěn)定持續(xù)表達(dá)。經(jīng)該試劑盒包裝獲得的對(duì)照質(zhì)粒病毒滴度可達(dá)108 TU/mL,。

ViralStars LP Lentivirus Packaging Kit慢病毒包裝試劑盒包含如下組分：

(1) 優(yōu)化配比的慢病毒包裝輔助質(zhì)?；旌衔铮≒ackage Plasmid Mix），經(jīng)過設(shè)計(jì)調(diào)整,，可兼容大多數(shù)慢病毒表達(dá)載體,，確保將重組子包裝成具有高感染率的慢病毒顆粒。

(2) 表達(dá)GFP 和 Puro標(biāo)記的對(duì)照質(zhì)粒（Control Plasmid）,，便于觀察病毒包裝效率及測定病毒滴度,。

(3) 高效轉(zhuǎn)染試劑（PolyShooter Transfection Reagent），具有更高的轉(zhuǎn)染效率和更低的細(xì)胞毒性,。

(4) 常用病毒感染增強(qiáng)試劑Polybrene,，能夠顯著提高病毒與細(xì)胞的接觸及感染效率。

02/產(chǎn)品組分

03/保存條件

冰袋（wet ice）運(yùn)輸,。-20℃ 保存,，有效期12 個(gè)月。

04/產(chǎn)品特點(diǎn)

* 簡單快速——操作簡單,，無需對(duì)包裝輔助質(zhì)粒進(jìn)行抽提,，也無需對(duì)包裝體系進(jìn)行優(yōu)化

* 病毒滴度高——可包裝出高滴度、高表達(dá)水平的慢病毒

* 應(yīng)用范圍廣——經(jīng)過設(shè)計(jì)及優(yōu)化配比,，兼容大多數(shù)慢病毒表達(dá)載體

05/實(shí)驗(yàn)流程概要

06/實(shí)驗(yàn)步驟

一,、重組慢病毒制備

1. 細(xì)胞準(zhǔn)備

轉(zhuǎn)染前一天，將4-6×106 個(gè)293T細(xì)胞接種到10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中,，使其在包裝時(shí)密度為70%-80%,，放置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)16 h～24 h,。

? 細(xì)胞狀態(tài)會(huì)極大影響病毒包裝效率,，待包裝細(xì)胞應(yīng)處于良好生長狀態(tài)，建議使用生長處于指數(shù)期,、存活率大于90% 的細(xì)胞進(jìn)行慢病毒包裝,。

? 該包裝系統(tǒng)與ViralStars Lentivirus Packaging Cell Line（CL110001）配合使用，可包裝出更高滴度,、更高表達(dá)水平的慢病毒,。

2. 慢病毒包裝

(1) 取10 μL慢病毒包裝輔助質(zhì)?；旌衔铮≒ackage Plasmid Mix）加入到2 mL離心管中，加入2.5 μg含有目的基因的慢病毒載體質(zhì)粒,，輕輕混合，加入32 μL PolyShooter 轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)?；旌?，室溫孵育3分鐘。

? 慢病毒載體質(zhì)粒需根據(jù)研究基因自行構(gòu)建,，應(yīng)使用無內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取,，保證質(zhì)粒A260/A280比值為1.8-2.0，濃度不低于500 ng/μL,。溶解后的質(zhì)粒切忌反復(fù)凍融,，需按照使用量進(jìn)行分裝并于-20℃保存。

(2) 往上述混合物中加入1.8 mL無血清無雙抗的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基,，輕輕混勻,，在室溫下靜置30分鐘，形成轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物,。

? 轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物在室溫下4個(gè)小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定,。

(3) 將上述1.8 mL轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物輕輕地逐滴均勻加入10 cm皿293T細(xì)胞中，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)皿混勻,，置于37℃,，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)產(chǎn)毒。

3. 收獲病毒

(1) 轉(zhuǎn)染24 h后,，可選擇棄去初始病毒上清液,，加入10-15 mL新鮮的*培養(yǎng)基(DMEM +10% FBS)至10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于37℃,，5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)(此步驟可選),。

(2) 轉(zhuǎn)染48 h后，收集病毒上清液,，再加入10-15 mL新鮮的*培養(yǎng)基(DMEM +10% FBS)至10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中,，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng),。

(3) 轉(zhuǎn)染72 h后,，觀察細(xì)胞狀態(tài)并拍照，進(jìn)行二次病毒上清液收集,，與48 h收集的上清液混合,，300xg離心10分鐘以除去細(xì)胞碎片，使用0.22 μm濾器過濾,，過濾后的上清液可直接感染目的細(xì)胞,，或使用慢病毒濃縮試劑盒(LC110R)濃縮后感染目的細(xì)胞,。

? 切忌反復(fù)凍融病毒，凍融一次病毒滴度將降低10-20%,。-80℃保存的慢病毒最好在半年內(nèi)使用,。

二、病毒滴度測定

1. 孔稀釋法標(biāo)定帶熒光的重組慢病毒滴度

(1) Day1：準(zhǔn)備細(xì)胞

對(duì)生長狀態(tài)良好的293T細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后稀釋至?1-3x105個(gè)?/mL?,，加入96孔板,，100?μL/孔（1-3x104個(gè)?/孔），每?種慢病毒設(shè)6個(gè)梯度孔,，置于37℃,，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

(2) Day2：病毒的稀釋與感染

在EP管中做10倍梯度稀釋,，連續(xù)6個(gè)稀釋梯度,。稀釋方法如下：準(zhǔn)備6個(gè)?菌EP管，每個(gè)EP管中加?90μL 新鮮的*培養(yǎng)基（含10 μg/mL polybrene）,，取待測定病毒液10 μL加?到第?個(gè)EP管中（標(biāo)記10 μL）,，混勻后取10 μL病毒稀釋液加?到第?個(gè)EP管中（標(biāo)記1 μL），以此類推,，直到稀釋到最后?管,。棄去96孔板中原有的培養(yǎng)基，將稀釋好的病毒依次加入孔中,，并做好標(biāo)記,，??操作，不要吹起細(xì)胞,，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h,。如需設(shè)置復(fù)孔，則按復(fù)孔的數(shù)量倍數(shù)增加以上用量,。

(3) Day3：棄病毒,，換液

吸去含病毒的培養(yǎng)基，在每個(gè)孔中再加入?100 μL?預(yù)熱的新鮮*培養(yǎng)基,。

(4) Day4：熒光計(jì)數(shù)與滴度計(jì)算

方法1：末位稀釋計(jì)數(shù)法

感染36-48 h后,，用熒光顯微鏡對(duì)熒光陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。數(shù)出最后兩孔的熒光細(xì)胞數(shù)(若設(shè)置了復(fù)孔,，則計(jì)算復(fù)孔內(nèi)的總數(shù)之和并計(jì)算出平均數(shù)),，假設(shè)為A(倒數(shù)第二孔的

熒光細(xì)胞數(shù)）和B（倒數(shù)第一孔的熒光細(xì)胞數(shù))。

慢病毒滴度計(jì)算公式1：病毒滴度 (TU/mL) =（A+B×10）×1000/2/A孔病毒量（μL）

舉例1：5號(hào)管對(duì)應(yīng)的熒光陽性細(xì)胞數(shù)為10個(gè),，6號(hào)管對(duì)應(yīng)的熒光陽性細(xì)胞數(shù)為2個(gè),，則病毒滴度為：

滴度（TU/mL）=?（?10+2x10）x1000/2/0.001?=?1.5x107

如果需要感染?2x105個(gè)細(xì)胞，MOI=5（1個(gè)細(xì)胞對(duì)應(yīng)5個(gè)病毒顆粒）,，則需病毒體積為：

所需病毒體積?=?2?x105x?5/1.5x107（mL）=?0.067?mL?=?67?μL

方法2：適量熒光計(jì)數(shù)法

感染36-48 h后,，用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞術(shù)對(duì)熒光比例合適（10%-50%）的連續(xù)兩個(gè)梯度進(jìn)行統(tǒng)計(jì),，數(shù)出兩孔的熒光細(xì)胞數(shù)(若設(shè)置了復(fù)孔，則計(jì)算復(fù)孔內(nèi)的總數(shù)之和并計(jì)算出平均數(shù)),，假設(shè)為 C（較高濃度孔的熒光細(xì)胞數(shù)）和D（較低濃度孔的熒光細(xì)胞數(shù)）,。

慢病毒滴度計(jì)算公式2：病毒滴度 (TU/mL) =（C+D×10）×1000/2/C孔病毒量（μL）

舉例2：3號(hào)管對(duì)應(yīng)的熒光陽性細(xì)胞數(shù)為10000個(gè)，4號(hào)管對(duì)應(yīng)的熒光陽性細(xì)胞數(shù)為2000個(gè),，則病毒滴度為：

滴度（TU/mL）=?（?10000+2000x10）x1000/2/0.1?=?1.5x108

如果需要感染?2x105個(gè)細(xì)胞,，MOI=30（1個(gè)細(xì)胞對(duì)應(yīng)30個(gè)病毒顆粒），則需病毒體積為：

所需病毒體積?=?2?x105x?30/1.5x108（mL）=?0.04?mL?=?40?μL

2. 相對(duì)定量PCR標(biāo)定非熒光的重組慢病毒滴度

(1) Day1：準(zhǔn)備細(xì)胞

對(duì)生長狀態(tài)良好的293T細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后稀釋至1-3x105個(gè)?/mL?,，加入24孔板，500?μL/孔（?0.5-1.5x105個(gè)?/孔）,，每?種慢病毒設(shè)6個(gè)梯度孔,，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),。

(2) Day2：病毒的稀釋與感染

在EP管中做10倍梯度稀釋,，連續(xù)6個(gè)稀釋梯度。稀釋方法如下：準(zhǔn)備6個(gè)?菌EP管,，每個(gè)EP管中加?450μL 新鮮的*培養(yǎng)基（含10 μg/mL polybrene）,，取待測定病毒液50 μL加?到第?個(gè)EP管中（標(biāo)記50 μL），混勻后取50 μL病毒稀釋液加?到第?個(gè)EP管中（標(biāo)記5 μL）,，以此類推,，直到稀釋到最后?管。棄去24孔板中原有的培養(yǎng)基,，將稀釋好的病毒依次加入孔中,，并做好標(biāo)記，??操作,，不要吹起細(xì)胞,，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h。如需設(shè)置復(fù)孔,，則按復(fù)孔的數(shù)量倍數(shù)增加以上用量,。

(3) Day3：棄病毒，換液

吸去含病毒的培養(yǎng)基,，在每個(gè)孔中再加入?500 μL?預(yù)熱的新鮮*培養(yǎng)基,。

(4) Day4：相對(duì)定量PCR與滴度計(jì)算

用PBS清洗并將細(xì)胞吹打下來，離心收集細(xì)胞,，進(jìn)行基因組DNA的提取,，qPCR檢測。以被測慢病毒載體梯度稀釋為標(biāo)準(zhǔn)品,，慢病毒載體上的通用引物進(jìn)行qPCR以獲得病毒整合拷貝數(shù),。以Actin質(zhì)粒梯度稀釋為標(biāo)準(zhǔn)品,，Actin引物進(jìn)行qPCR檢測樣品的基因組拷貝數(shù)以得到基因組拷貝數(shù)。

慢病毒滴度計(jì)算公式3：滴度（IU/mL）=(E×N×1000)/對(duì)應(yīng)孔病毒量（μL）,，其中E=平均每基因組慢病毒整合拷貝數(shù),，N=感染時(shí)細(xì)胞的數(shù)目（約為1.5×105）。

? 測定時(shí),，設(shè)置一組帶熒光的已知TU的慢病毒作為對(duì)照,，以校驗(yàn)檢測出的數(shù)值。

三,、慢病毒感染目的細(xì)胞

VSVG包膜蛋白對(duì)不同的細(xì)胞和組織的親嗜性有很大差異,，在使用慢病毒感染目的細(xì)胞之前，需要查閱相關(guān)文獻(xiàn)或進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)確定目的細(xì)胞的復(fù)感染指數(shù)（MOI,，multiplicity of infection）,。

1. 按照上述步驟包裝慢病毒及確定慢病毒滴度，通過病毒滴度和MOI計(jì)算所需病毒量（計(jì)算公式參考06/實(shí)驗(yàn)步驟/病毒滴度測定）,。

2. 實(shí)驗(yàn)前一天,，將生長狀態(tài)良好的目的細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后稀釋至1-3×105/mL，加入12孔板,，1 mL/孔,。放入37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),。

? 懸浮細(xì)胞不需要提前一天接種,，實(shí)驗(yàn)前將細(xì)胞計(jì)數(shù)接種后，直接加入病毒混合液即可,。

3. 配制慢病毒+polybrene+培養(yǎng)基混合液,。polybrene為常用的促感染試劑，能夠顯著提高病毒與細(xì)胞的接觸及感染效率,，一般使用濃度為2-10 μg/mL,，但對(duì)某些細(xì)胞（如末端分化的神經(jīng)元，DC細(xì)胞等）毒性較大,，初次使用建議先做毒性測試,。

4. 吸去12孔板中目的細(xì)胞的培養(yǎng)基，加入3中配制的慢病毒混合液,，放入37℃,，5% CO2 培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

? 感染懸浮細(xì)胞或半懸浮細(xì)胞,，則需采用平角離心轉(zhuǎn)染法,，即將適量的病毒液加入細(xì)胞培養(yǎng)板后，封好口，放入平角離心機(jī)中,，低速（200xg）離心?1 h?,，然后放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

? 若實(shí)驗(yàn)條件有限,，沒有平角離心機(jī),，可用離心管代替，將細(xì)胞吸入離心管中,，進(jìn)行低速離心,，去掉大部分上清，加入適量的病毒液,，室溫放置?15 min,，然后將細(xì)胞和病毒液同時(shí)吸出轉(zhuǎn)入培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)。

5. 病毒感染16 h后更換為新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),。

6. 病毒感染36-48 h后,，熒光顯微鏡下觀察熒光表達(dá)情況。

7. 若表達(dá)效果不理想,，可調(diào)整MOI（例如，設(shè)置MOI梯度）再次檢測,。

07/適用范圍

兼容大多數(shù)慢病毒表達(dá)載體,，經(jīng)過設(shè)計(jì)及優(yōu)化配比，確保將重組子包裝成具有高感染率的慢病毒顆粒,，同時(shí)防止病毒的自我復(fù)制,。

08/注意事項(xiàng)

1. 該系統(tǒng)與ViralStars Lentivirus Packaging Cell Line（CL110001）配合使用，可包裝出更高滴度,、更高表達(dá)水平的慢病毒,。

2. 在收獲粗病毒后，建議額外分裝幾支20-100 µL小體積管,，和其他分裝的大體積病毒一并置于-80℃保存,。待這些小體積病毒結(jié)冰后，取出來融化,，再測定滴度,。這一步可以模擬一次凍融帶來的活性滴度下降，這樣測得的滴度才是真正具有參考價(jià)值的,。

3. 為了您的健康安全,，請(qǐng)規(guī)范操作，穿戴實(shí)驗(yàn)服與手套開展實(shí)驗(yàn),。

4. 所有慢病毒操作均需在BSL2級(jí)生物安全柜中進(jìn)行,。

5. 本產(chǎn)品僅供科研使用，請(qǐng)勿用于臨床診斷及治療。

09/實(shí)驗(yàn)案例分析

1. 提前一天使用10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿培養(yǎng)ViralStars Lentivirus Packaging Cell Line（CL110001）,，待細(xì)胞密度為75% 左右開始包裝慢病毒,。

2. 使用ViralStars LP Lentivirus Packaging Kit（LP110-10）進(jìn)行慢病毒包裝。取10 μL慢病毒包裝輔助質(zhì)?；旌衔铮≒ackage Plasmid Mix）加入到2 mL離心管中,，加入2.5 μL表達(dá)GFP 的對(duì)照質(zhì)粒（Control Plasmid），輕輕混合,，加入32 μL PolyShooter轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)?；旌希覝胤跤?分鐘,。

3. 往上述混合物中加入1.8 mL無血清無雙抗的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基,，輕輕混勻，在室溫下靜置30分鐘,，形成轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物,。

4. 將上述1.8 mL轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物輕輕地逐滴均勻加入10 cm皿慢病毒包裝細(xì)胞中，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)皿混勻,，置于37℃,，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)產(chǎn)毒。

5. 轉(zhuǎn)染24 h后,，棄去初始病毒上清液,，加入10 mL新鮮的*培養(yǎng)基(DMEM +10% FBS)至10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于37℃,，5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng),。

6. 轉(zhuǎn)染48 h后，收集病毒上清液,，再加入10 mL新鮮的*培養(yǎng)基(DMEM +10% FBS)至10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中,，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng),。

7. 轉(zhuǎn)染72 h后,，觀察細(xì)胞狀態(tài)并拍照，進(jìn)行二次病毒上清液收集,，與48 h收集的上清液混合后,，300xg離心10分鐘以除去細(xì)胞碎片，0.22 μm濾器過濾,，使用ViralStars LC Lentivirus Concentration Solution慢病毒濃縮試劑盒（LC110R）進(jìn)行20倍濃縮,，使用1 mL ViralStars LS Lentivirus Storage Solution（LS110R）重懸慢病毒顆粒。

8. 孔稀釋法測定病毒滴度（參考06/實(shí)驗(yàn)步驟中病毒滴度測定方法）,，使用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況,，并拍照記錄,，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

10/其他相關(guān)產(chǎn)品