ViralStars^TM  Lentivirus Packaging Cell Line

Catalog Number：CL110001

01/產(chǎn)品概述

慢病毒是一種逆轉錄病毒，能使外源基因整合入宿主細胞的基因組,，實現(xiàn)外源基因穩(wěn)定,、長期的表達，比一般的逆轉錄病毒具有更高的滴度和更廣的宿主范圍,。攜帶外源基因的慢病毒載體與包裝載體（產(chǎn)生病毒顆粒所需的輔助蛋白）一同轉染包裝細胞,，即可進行病毒的包裝。包裝好的慢病毒為假型病毒（病毒感染目的細胞后不會再感染其他細胞,，也不會利用宿主細胞產(chǎn)生新的病毒顆粒,，慢病毒中的毒性基因已被剔除并被外源性目的基因所取代），分泌到細胞外的培養(yǎng)基中,，經(jīng)過離心取得上清液后進行慢病毒濃縮,，濃縮后的慢病毒液可以直接用于宿主細胞的感染,，目的基因進入到宿主細胞后，經(jīng)過反轉錄,，整合到基因組,，從而實現(xiàn)外源基因在宿主細胞中的表達（下圖）。

要充分利用慢病毒包裝系統(tǒng)產(chǎn)生高滴度的慢病毒顆粒,，就需要宿主細胞系具備易于轉染并且可以高水平表達病毒蛋白質(zhì)的特性,。我們的ViralStars Lentivirus Packaging Cell Line經(jīng)過了克隆篩選，可以充分滿足這些需求,。當與我們優(yōu)質(zhì)的ViralStars LP Lentivirus Packaging Kit（LP110）高滴度慢病毒包裝試劑盒配合使用時,，可以獲得更高的慢病毒滴度（高達10⁸ TU/mL）。ViralStars Lentivirus Packaging Cell Line是人胚胎腎細胞轉化細胞HEK 293的亞克隆,，經(jīng)過基因編輯改進后篩選出的單克隆細胞株,，具備高細胞活性、低細胞凋亡水平,、可高度轉染并高水平表達病毒蛋白質(zhì)等特性,。

02/產(chǎn)品組分

03/保存條件

為確保細胞活力，細胞產(chǎn)品接收后應立即進行細胞培養(yǎng)及后續(xù)操作（詳見05/實驗步驟）,。

04/產(chǎn)品特點

2 高細胞活性,、低細胞凋亡水平

2 高度易于轉染

2 高水平表達重組慢病毒

05/實驗步驟

一、ViralStars Lentivirus Packaging Cell Line細胞傳代

1. 待細胞密度達90% 左右,，即可進行傳代培養(yǎng),。棄去舊培養(yǎng)基，用PBS潤洗細胞1-2次,。

2. 加入適量胰酶消化液,，置于37℃培養(yǎng)箱中消化細胞約1-2分鐘，顯微鏡下觀察細胞消化情況,，若觀察到大部分細胞變圓并脫落,，則迅速拿回操作臺，加入與胰酶等量的*培養(yǎng)基（DMEM,，10% FBS,，1% 雙抗）終止消化。

3. 輕輕吹打細胞,，使細胞*脫落后吸出,，1000 rpm離心5分鐘，棄去上清液,，用新鮮的*培養(yǎng)基重懸細胞,。

4. 將細胞懸液按合適的比例（推薦1:4-1:5）接種到新的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中，置于37℃ 5% CO₂培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

二,、ViralStars Lentivirus Packaging Cell Line細胞凍存

1. 選擇處于指數(shù)生長期的細胞,，按照常規(guī)方法收集細胞于離心管中。

2. 1000 rpm,，離心5分鐘,，收集培養(yǎng)細胞沉淀，棄上清液,。

3. 加入適量4℃預冷的LeapWal Cell Freezing Medium (1x)(PZ110R) 重懸細胞,，制成細胞懸液。

? 按照細胞密度和所用細胞凍存管的尺寸計算所需凍存液的量,，推薦凍存密度：1x10⁶ 至5x10⁶ cells/mL,。

4. 將細胞懸液分裝至已標記的凍存管中，建議每管1mL或1.5mL,。

5. 直接將細胞凍存管放入-80℃超低溫冰箱中,，可長期冷凍保存。如果想放入液氮中長期保存,，需先放入-80℃冰箱至少12小時,，方可移至液氮罐中長期保存。

三,、ViralStars Lentivirus Packaging Cell Line細胞復蘇

1. 在15 mL離心管中加入5-10 mL平衡至室溫的*培養(yǎng)基,。

2. 從-80℃冰箱/液氮中取出凍存的細胞，立即放入37℃水浴鍋或其他細胞復蘇設備中,，迅速解凍,。

3. 將凍存管中的細胞懸液逐滴轉移至預先準備好的含*培養(yǎng)基的離心管中，1000 rpm,，離心5分鐘,，收集細胞沉淀，棄上清（操作時小心,，切勿將細胞沉淀移去）,。

4. 加入適量平衡至室溫的*培養(yǎng)基重懸細胞,，接種到事先準備好的培養(yǎng)容器中,，輕輕搖晃培養(yǎng)容器，使細胞分布均勻,。

5. 培養(yǎng)5-16 h后,，觀察細胞狀態(tài)，可視情況更換預熱的新鮮*培養(yǎng)液,，之后進行常規(guī)細胞培養(yǎng)及傳代,。

06/適用范圍

ViralStars Lentivirus Packaging Cell Line經(jīng)過了基因編輯及單克隆篩選，具備高細胞活性,、低細胞凋亡水平,、可高度轉染并高水平表達病毒蛋白等特性,，兼容所有慢病毒包裝體系。

07/注意事項

1. 該產(chǎn)品與我們優(yōu)質(zhì)的ViralStars LP Lentivirus Packaging Kit（LP110）高滴度慢病毒包裝試劑盒配合使用時,，可以獲得更高的慢病毒滴度（高達10⁸ TU/mL）,。

2. 為了您的健康安全，請規(guī)范操作,，穿戴實驗服與手套開展實驗,。

3. 所有慢病毒操作均需在BSL2級生物安全柜中進行。

4. 本產(chǎn)品僅供科研使用,，請勿用于臨床診斷及治療,。

08/實驗案例分析

1. 提前一天使用10 cm細胞培養(yǎng)皿培養(yǎng)ViralStars Lentivirus Packaging Cell Line（CL110001）及其它兩種常用HEK 293包裝細胞系（HEK293T、293FT）,，待細胞密度為75% 左右開始包裝慢病毒,。

2. 使用ViralStars LP Lentivirus Packaging Kit（LP110-10）進行慢病毒包裝。取3個2 mL EP管,，分別加入10 μL慢病毒包裝輔助質(zhì)?；旌衔铮≒ackage Plasmid Mix），2.5 μL表達GFP的對照質(zhì)粒（Control Plasmid）,，輕輕混合,，加入32 μL PolyShooter轉染試劑與質(zhì)粒混合,，室溫孵育3分鐘,。

3. 往上述混合物中加入1.8 mL無血清無雙抗的DMEM基礎培養(yǎng)基，輕輕混勻,，在室溫下靜置30分鐘,，形成轉染試劑-核酸復合物。

4. 將上述1.8 mL轉染試劑-核酸復合物輕輕地逐滴均勻加入10 cm皿慢病毒包裝細胞中,，輕輕搖動培養(yǎng)皿混勻,，做好標記，置于37℃,，5% CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)產(chǎn)毒,。

5. 轉染24 h后，棄去初始病毒上清液,，加入10 mL新鮮的*培養(yǎng)基(DMEM +10% FBS)至10 cm細胞培養(yǎng)皿中,，置于37℃，5% CO₂培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng),。

6. 轉染48 h后,，收集病毒上清液，再加入10 mL新鮮的*培養(yǎng)基(DMEM +10% FBS)至10 cm細胞培養(yǎng)皿中，置于37℃,，5% CO₂培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng),。

7. 轉染72 h后，進行二次病毒上清液收集,，與48 h收集的上清液混合后,，300xg離心10分鐘以除去細胞碎片，0.22 μm濾器過濾,，使用ViralStars LC Lentivirus Concentration Solution慢病毒濃縮試劑盒（LC110R）進行20倍濃縮,，使用1 mL ViralStars LS Lentivirus Storage Solution（LS110R）分別重懸三組慢病毒顆粒。

8. 孔稀釋法測定病毒滴度,。

(1) Day1：準備細胞

對生長狀態(tài)良好的293T細胞消化計數(shù)后稀釋至?1-3x10⁵個?/mL?,，加入96孔板，100?μL/孔（1-3x10⁴個?/孔）,，每?種慢病毒設6個梯度孔,，置于37℃，5% CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng),。

(2) Day2：病毒的稀釋與感染

在EP管中做10倍梯度稀釋,，連續(xù)6個稀釋梯度。稀釋方法如下：準備6個?菌EP管,，每個EP管中加?90μL 新鮮的*培養(yǎng)基（含10 μg/mL polybrene）,，取待測定病毒液10 μL加?到第?個EP管中（標記10 μL），混勻后取10 μL病毒稀釋液加?到第?個EP管中（標記1 μL）,，以此類推,，直到稀釋到最后?管。棄去96孔板中原有的培養(yǎng)基,，將稀釋好的病毒依次加入孔中,，并做好標記，??操作,，不要吹起細胞,，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h。

(3) Day3：棄病毒,，換液

吸去含病毒的培養(yǎng)基,，在每個孔中再加入?100 μL?預熱的新鮮*培養(yǎng)基。

(4) Day4：熒光計數(shù)與滴度計算

感染36-48 h后,，采用流式細胞術對熒光比例合適（10%-50%）的連續(xù)兩個梯度進行陽性細胞統(tǒng)計,，計算出病毒滴度,，實驗結果如圖2所示,。

圖2: ViralStars Lentivirus Packaging Cell Line慢病毒包裝細胞系可制備出更高滴度的慢病毒顆粒,。

我們使用ViralStars LP Lentivirus Packaging Kit（LP110-10）進行慢病毒包裝,，比較ViralStars Lentivirus Packaging Cell Line和其它兩種常用HEK 293包裝細胞系的病毒制備能力，ViralStars Lentivirus Packaging Cell Line明顯優(yōu)于其他細胞系——所獲得的病毒滴度比293FT細胞高出10倍,，比親代HEK 293細胞系高出26倍,。

09/其他相關產(chǎn)品