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廣州市艾貝泰生物科技有限公司

GSK:使用單一DNA結(jié)構(gòu)快速構(gòu)建穩(wěn)定的慢病毒載體生產(chǎn)細(xì)胞系

時間:2022-6-1 閱讀:356
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慢病毒載體(Lentiviral vectors, LVs)是以人類免疫缺陷型病毒(HIV)為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體,,被廣泛應(yīng)用的慢病毒載體是基于雙鏈RNA病毒人類免疫缺陷I型病毒(HIV-1)[1]。HIV-1型慢病毒載體系統(tǒng)的建立,,經(jīng)歷了一個逐步完善的過程,,其生物安全性不斷提高。

LVs對分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能力,,更加安全,,并可以在體內(nèi)長期的表達(dá)。這一特性使LVs成為臨床研究的理想選擇,,美國食品和藥物管理局(FDA)和歐洲藥物管理局(EMA)已經(jīng)批準(zhǔn)多個以慢病毒為基礎(chǔ)的基因療法,。目前,LVsβ-地中海貧血(β-thalassemia),、鐮狀細(xì)胞性貧血(Sickle cell anemia),、實(shí)體瘤(Solid tumors)和COVID-19等疾病(圖1)的細(xì)胞和基因治療中得到了廣泛的應(yīng)用,,如CAR-T細(xì)胞治療,。

 

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圖1:使用LVs的臨床試驗(yàn)數(shù)量最多的主要疾[2]

臨床試驗(yàn)需要大量功能性慢病毒顆粒,提高慢病毒的包裝與生產(chǎn)水平可有效促進(jìn)慢病毒介導(dǎo)的基因治療的發(fā)展,。LVs通常是通過將編碼載體組分的多質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染到貼壁HEK293T細(xì)胞中來生產(chǎn),。瞬時轉(zhuǎn)染的方式需要耗費(fèi)很高的成本和很長的時間來獲取質(zhì)粒DNA,從而使生產(chǎn)過程極其昂貴,;在放大過程中,,質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑的殘留,也會引起終產(chǎn)物的污染,。相較于瞬時轉(zhuǎn)染生產(chǎn),,穩(wěn)定的慢病毒生產(chǎn)才是基因治療的更優(yōu)選擇。穩(wěn)定生產(chǎn)細(xì)胞株將其所有載體編碼的DNA都穩(wěn)定地整合到宿主細(xì)胞基因組中,,可以降低生產(chǎn)成本,、提高整體安全性和可重復(fù)性。

英國著名的葛蘭素史克藥物研究中心報(bào)告了一種通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染編碼所有慢病毒載體成分的單個 DNA 結(jié)構(gòu)體到 293T 細(xì)胞,,快速生成穩(wěn)定生產(chǎn)慢病毒載體的細(xì)胞系的方法,。由此產(chǎn)生的穩(wěn)定懸浮細(xì)胞系可生產(chǎn)出與瞬時轉(zhuǎn)染一樣高滴度的慢病毒,,可以在一次性攪拌式生物反應(yīng)器中輕松放大,并且在后續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)中遺傳和功能穩(wěn)定,。通過在慢病毒載體的上游加工過程中消除對有效瞬時轉(zhuǎn)染的要求,,并改用固有的可擴(kuò)展懸浮細(xì)胞培養(yǎng)形式,他們認(rèn)為這種方法將生產(chǎn)出比當(dāng)前制造工藝更高的批量產(chǎn)量,,并使患者能夠更好地獲得基于慢病毒載體的藥物[3],。

 




載體構(gòu)建

 

LVs生產(chǎn)細(xì)胞株通常是基于順序穩(wěn)定轉(zhuǎn)染或?qū)⒕幋a每個載體組分(轉(zhuǎn)移質(zhì)粒、包裝質(zhì)粒gagpol-rev和包膜質(zhì)粒VSVg)的DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)到基因組不同位點(diǎn)的宿主細(xì)胞,。這種策略導(dǎo)致細(xì)胞系開發(fā)時間長,,并且至少有一個基因座可能發(fā)生遺傳或轉(zhuǎn)錄不穩(wěn)定的高風(fēng)險(xiǎn),從而導(dǎo)致生產(chǎn)力損失,。為了避免這種情況,,GSK使用第三代慢病毒載體系統(tǒng),載體組件由四個獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄單元編碼,,每個單元都有自己的啟動子和多聚腺苷酸化信號,,防止產(chǎn)生復(fù)制能力強(qiáng)的慢病毒(RCL)顆粒,,一個將所有的載體成分構(gòu)建成單個大DNA結(jié)構(gòu)(BAC)并整合入宿主細(xì)胞(圖2),。

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圖2:BAC載體結(jié)構(gòu)

 




慢病毒載體穩(wěn)定生產(chǎn)細(xì)胞系的開發(fā)

 

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慢病毒載體的穩(wěn)定生產(chǎn)

 

利用微滴式數(shù)字PCR (ddPCR)定量每個載體成分DNA拷貝數(shù),每個成分的拷貝數(shù)在1到10拷貝數(shù)/細(xì)胞之間變化(圖4A),。通過靶向位點(diǎn)擴(kuò)增技術(shù)(Targeted locus amplification,,TLA)對293Tsa EGFP clone 2的BAC DNA進(jìn)行整合位點(diǎn)定位,在chr3:169,967,149-169,967,179處發(fā)現(xiàn)了一個整合位點(diǎn)(圖4B),,在293Tsa GLOBE clone 19中,,于chrl: 146,557,007和chrX: 127,363,436處發(fā)現(xiàn)了兩個整合位點(diǎn)(圖4C),表明BAC DNA在隨機(jī)整合到宿主細(xì)胞基因組之前發(fā)生了異位串聯(lián),,轉(zhuǎn)染圓形的BAC DNA質(zhì)粒,,宿主的DNA修復(fù)蛋白會對其進(jìn)行重排,從而產(chǎn)生線性整合DNA,。

以MOI=50或100的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)CD34+細(xì)胞,,通過qPCR檢測轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的載體拷貝數(shù)(VCN),重復(fù)轉(zhuǎn)導(dǎo)使得每個細(xì)胞產(chǎn)生2個拷貝的VCN,,表明穩(wěn)定的細(xì)胞系產(chǎn)生的病毒載體可以感染類似難以感染的原代細(xì)胞(圖4D),。

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圖4:293Tsa EGFP clone 2和293Tsa GLOBE clone 19

 




慢病毒穩(wěn)定包裝和瞬時轉(zhuǎn)染生產(chǎn)對比

 

構(gòu)建相同的4質(zhì)粒系統(tǒng)瞬時轉(zhuǎn)染293Tsa細(xì)胞,通過RNA測序(RNA-seq)來定量各載體組分的RNA水平,。各組分的RNA瞬時表達(dá)和穩(wěn)定表達(dá)之間沒有顯著差異,,只有293Tsa GLOBE clone 19的rev表達(dá)升高(rev比瞬時表達(dá)高2.88倍,p = 0.0003),;并且,,穩(wěn)定克隆的不同培養(yǎng)瓶之間每個載體組分的RNA表達(dá)水平的變異性顯著低于瞬時表達(dá)(p < 0.001) (圖5A),。另外,瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定表達(dá)的慢病毒在病毒滴度效價方面均未觀察到顯著差異(圖5B),。

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圖5:慢病毒穩(wěn)定表達(dá)與瞬時轉(zhuǎn)染表達(dá)對比

 




穩(wěn)定包裝生產(chǎn)慢病毒的功能和遺傳穩(wěn)定性驗(yàn)證

 

使用低溫儲存的12個單克隆細(xì)胞進(jìn)行排序,,在15ml一次性攪拌槽微生物反應(yīng)器中制備慢病毒載體并檢測其病毒滴度(圖6A)。選取效價最高的4個克?。?/span>clone1, 3, 9, 10)連續(xù)搖瓶培養(yǎng)數(shù)周來評估病毒滴度和遺傳穩(wěn)定性,,使用選取三個時間點(diǎn),在強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)下,,使用ddPCRELISA法對比病毒滴度,,clone3, 9, 10的病毒滴度沒有顯著變化,clone1的滴度下降(p = 0.0011)(圖6B),;在相同的三個時間點(diǎn),,采集非誘導(dǎo)的細(xì)胞基因組DNA檢測BAC各基因拷貝數(shù)量變化,四個克隆在遺傳上都是穩(wěn)定的,,既沒有丟失整合DNA編碼的載體成分,,也沒有通過重復(fù)感染擴(kuò)增轉(zhuǎn)移載體拷貝數(shù)(VCN)(圖6B)。

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圖6:293Tsa GLOBE.T87Q的病毒滴度和遺傳穩(wěn)定性

 




具有復(fù)制能力的慢病毒(RCL)的檢測

 

為了測定這些克隆細(xì)胞是否會產(chǎn)生RCL,,采用產(chǎn)物增強(qiáng)逆轉(zhuǎn)錄酶(PERT)檢測了12個樣品,,這12個樣品分別來自293Tsa EGFP clone 2、GLOBE clone 19和GLOBE.T87Q clone 1,、3,、9和10這6個克隆細(xì)胞的的收集樣品和濃縮后樣品。結(jié)果顯示,,這些穩(wěn)定生產(chǎn)的細(xì)胞系中都沒有檢測到RCL(表1),。

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表1:RCL檢測結(jié)果

 




總結(jié)

 

在GSK分享的單DNA分子BAC結(jié)構(gòu)中將CMV啟動子驅(qū)動的轉(zhuǎn)錄單元以transfer-gagpol-VSVg-rev的順序首尾1:1:1:1相連排列,但是也發(fā)現(xiàn),,在相同的BAC轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,,不同的單克隆細(xì)胞的每個載體基因DNA拷貝數(shù)和mRNA表達(dá)水平存在差異。因此,,在細(xì)胞系構(gòu)建的過程中,,應(yīng)篩選足夠數(shù)量的克隆,以獲得一個mRNA表達(dá)水平理想的克隆,,獲得最佳的產(chǎn)量和感染性,。將BAC結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞后,根據(jù)經(jīng)驗(yàn)?zāi)軌驈膸资畟€單克隆細(xì)胞系中篩選出高產(chǎn)的克隆,,因此GSK認(rèn)為,,這種包裝細(xì)胞系的方法能夠減少克隆之間變異。未來也可以進(jìn)一步的載體改造,,將其中的基因片段用改進(jìn)的基因進(jìn)行替換,,快速利用多個片段組裝或基因合成為一個BAC片段,,單次的轉(zhuǎn)染能簡化并加速慢病毒穩(wěn)定生產(chǎn)細(xì)胞株的構(gòu)建流程,提高慢病毒載體的產(chǎn)量,、質(zhì)量和安全性,。FDA和EMA也認(rèn)為這種穩(wěn)定生產(chǎn)慢病毒的細(xì)胞系平臺可用于生產(chǎn)臨床使用的慢病毒,也沒有提出慢病毒載體制造工藝之外的要求,。這種簡單有效的生產(chǎn)細(xì)胞株培養(yǎng)技術(shù),,可廣泛應(yīng)用于慢病毒載體制造的產(chǎn)業(yè)化,并有可能在未來為更多的患者提供基因治療藥物,。

瞬時轉(zhuǎn)染為基礎(chǔ)的慢病毒載體制造工藝用于臨床是基因治療領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法,,但通常需要大量GMP級別的質(zhì)粒DNA和轉(zhuǎn)染試劑。相比較之下,,構(gòu)建穩(wěn)定的生產(chǎn)細(xì)胞株更適合于大規(guī)模的慢病毒的生產(chǎn),,建高產(chǎn)細(xì)胞株的主要流程如圖6所示,經(jīng)過單克隆細(xì)胞篩選,、擴(kuò)增培養(yǎng)和驗(yàn)證,,最終獲得細(xì)胞活力高、生長能力強(qiáng),,并且表達(dá)水平,、穩(wěn)定性、質(zhì)量情況都具有高表現(xiàn)的單克隆細(xì)胞株,。

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圖7:細(xì)胞系構(gòu)建的流程

GSK利用Cytena單細(xì)胞打印機(jī)替代常規(guī)的有限稀釋的方法篩選單克隆細(xì)胞,,由于其溫和而高效的分選原理,使得單細(xì)胞率>95%,,克隆恢復(fù)率與有限稀釋相當(dāng),獲得大量單克隆來源的細(xì)胞,,并提供分選過程中的噴嘴圖片作為單克隆細(xì)胞來源的佐證,,進(jìn)一步加速慢病毒生產(chǎn)細(xì)胞株構(gòu)建的工作流程,促進(jìn)基因與細(xì)胞治療的發(fā)展,。

 


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