圖一,、pH輔助LNP噴霧干燥示意圖

實驗結果

2.1 粉末制備與表征：

本研究采用pH調(diào)節(jié)的SFD技術成功制備了mRNA-LNPs吸入性粉末。通過調(diào)節(jié)溶液在SFD過程中的pH值,，增強了mRNA與LNPs中可電離脂質之間的相互作用,，從而保留了封裝結構。制備的粉末呈現(xiàn)出適合吸入的特性,，mRNA在SFD后仍然被封裝在LNPs內(nèi),。

表二,、噴霧干燥后LNP重新水花后的理化性質表征

2.2 理化性質分析：

• 粒徑與電位：使用ZetaSizer Nano對重新水合的mRNA-LNPs進行粒徑測定,，結果顯示，盡管SFD后mRNA-LNPs的粒徑有所增加,，但仍在可接受的范圍內(nèi)（約100-150nm）,，且未觀察到明顯聚集,。Zeta電位測定也證實了粉末的穩(wěn)定性。

• 封裝效率與mRNA完整性：通過電泳分析評估了mRNA的完整性,，結果顯示,，在pH 3和5條件下進行SFD時，大部分mRNA仍然保留在LNPs內(nèi)部,，且mRNA未發(fā)生降解,。同時，測定了mRNA的封裝效率,，發(fā)現(xiàn)pH調(diào)節(jié)后的SFD方法提高了封裝效率,。

• 形態(tài)觀察：使用透射電子顯微鏡（TEM）觀察了原始液態(tài)和粉末狀mRNA-LNPs的形態(tài)，結果顯示,，粉末狀mRNA-LNPs在重新水合后保持了良好的形態(tài)結構,。

  
  

  
  

圖二、噴霧干燥后LNP的表征

圖三,、噴霧干燥后LNP重新水化的形態(tài)表征

2.3 生物活性評估

• 細胞表達活性：將制備的粉末狀mRNA-LNPs分散在培養(yǎng)基中,，并添加到A549和RPMI 2650細胞中，評估其蛋白表達活性,。結果顯示,，在pH 5條件下制備的粉末狀mRNA-LNPs在兩種細胞中均表現(xiàn)出最高的Luc（熒光素酶）表達水平。此外,，ZsGreen1（一種綠色熒光蛋白）的表達也呈現(xiàn)出類似的趨勢,。

• 細胞內(nèi)分布與攝取：使用流式細胞術和共聚焦激光掃描顯微鏡（CLMS）評估了粉末狀mRNA-LNPs在細胞內(nèi)的分布和攝取情況。結果顯示,，盡管在pH 5條件下制備的粉末狀mRNA-LNPs的細胞內(nèi)攝取量不是最高的,，但其蛋白表達水平卻是最高的。這表明,，pH調(diào)節(jié)可能增強了mRNA向LNPs的封裝效率,，而不是直接促進了細胞內(nèi)攝取。

• 長期儲存穩(wěn)定性：評估了粉末狀mRNA-LNPs在長期儲存后的穩(wěn)定性,。結果顯示,，在pH 5條件下制備的粉末狀mRNA-LNPs在儲存105天后仍然保持了較高的蛋白表達水平，而未進行pH調(diào)節(jié)的粉末狀mRNA-LNPs在儲存105天后蛋白表達水平幾乎無法檢測到,。此外,，與原始液態(tài)mRNA-LNPs相比，粉末狀mRNA-LNPs在儲存62天后表現(xiàn)出更高的mRNA轉染效率,。

• 氣管內(nèi)給藥效果：將粉末狀和液態(tài)mRNA-LNPs氣管內(nèi)給予小鼠,，并評估了其在肺部的蛋白表達水平。結果顯示,，與液態(tài)mRNA-LNPs相比,，粉末狀mRNA-LNPs在小鼠肺部表現(xiàn)出較低的蛋白表達水平,，但仍然具有顯著的生物活性。這表明,，粉末狀mRNA-LNPs可能適用于吸入性給藥。
  

圖五,、噴霧干燥后LNP的體外表達表征

圖六,、噴霧干燥后LNP的穩(wěn)定性表征

結論

參考文獻：Ogawa, Koki, et al. "Stable and inhalable powder formulation of mRNA-LNPs using pH-modified spray-freeze drying." International Journal of Pharmaceutics 665 (2024): 124632.