四價(jià)mRNA疫苗激發(fā)針對(duì)牛痘和猴痘病毒抗原的有效免疫應(yīng)答
2022年人類猴痘病毒感染的quanqiu暴發(fā)引起了公眾對(duì)人畜共患疾病人際傳播威脅的衛(wèi)生關(guān)注,。
鑒于有證據(jù)表明,，包括牛痘和駱駝痘在內(nèi)的其他正痘病毒也報(bào)告對(duì)人類具有傳染性，并且存在天花從實(shí)驗(yàn)室意外逃逸的風(fēng)險(xiǎn),，此迫切需要開(kāi)發(fā)一種具有廣泛預(yù)防正痘病毒的痘病毒疫苗,，以儲(chǔ)備以應(yīng)對(duì)未來(lái)的緊急情況,。
在這項(xiàng)研究中，我們構(gòu)建了一種新的痘病毒候選疫苗mRNA-ALAB-LNP,，編碼牛痘病毒抗原A27,、L1、A33和B5,。單次免疫后,，小鼠即產(chǎn)生強(qiáng)效的抗L1特異性抗體，和中等程度的抗A33-,、抗A27 -和抗B5特異性抗體反應(yīng),。第二次接種后，四種抗原的抗體反應(yīng)均顯著增強(qiáng),，IgG滴度均>5 logs,，其中抗A33的 IgG滴度zuigao。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
設(shè)計(jì)了一個(gè)常規(guī)的mRNA序列,，包含帽結(jié)構(gòu),、5'UTR非翻譯區(qū)、CDS翻譯區(qū),、3'UTR非翻譯區(qū)和PolyA 結(jié)構(gòu),。CDS翻譯區(qū)表達(dá)4個(gè)串聯(lián)的VACV抗原分子(A27, L1, A33, B5)被連接體分離，mRNA分子命名為mRNA- ALAB,。在完整的mRNA序列的5'端添加一個(gè)T7啟動(dòng)子和在3'端添加一個(gè)BspQI限制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn)（圖1A）,。用BspQI酶切質(zhì)粒可以有效地線性化質(zhì)粒模板(圖1B),。以線性化質(zhì)粒為模板,，通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成了mRNA-ALAB分子。瓊脂糖凝膠電泳和HPLC-SEC分析表明,，合成mRNA具有良好的完整性(圖1C)和純度(圖1D),。
圖1: mRNA-ALAB的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)和制備
本研究中，使用邁安納微流控設(shè)備INano L進(jìn)行脂質(zhì)和RNA的充分混合,，空載LNP和包載了RNA的LNP的粒徑分別為75nm和84nm（圖2B）,，PDI<0.1顯示了良好的均一性，包封率約為98%,。轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,，抗A27, L1, A33, B5的陽(yáng)性率分別為20%, 85%, 6% 和75%（圖3）。
圖2: mRNA-ALAB-LNP的準(zhǔn)備和表征
圖3: 轉(zhuǎn)染mRNA-ALAB-LNP后四種靶蛋白的表達(dá)
mRNA-ALAB-LNP疫苗在小鼠中誘導(dǎo)了強(qiáng)效的抗原特異性結(jié)合抗體反應(yīng)
為了研究mRNA疫苗的免疫原性,，6-8周齡BALB/c小鼠以2周間隔肌肉注射2次疫苗(圖4A) ,，每次注射劑量為20ug。于shouci注射前3天,、第14天(shouci注射后2周),、第28天(shouci注射后4周)和第42天(增強(qiáng)注射后2周),，采血取樣，檢測(cè)抗原特異性結(jié)合抗體(圖4B-4E),。第二次免疫后45 d取脾進(jìn)行細(xì)胞免疫評(píng)價(jià),。在diyi次免疫后，誘導(dǎo)了強(qiáng)效的抗L1特異性和中等的抗A33 -,、抗A27 -和抗B5特異性抗體反應(yīng),，并且針對(duì)所有四種抗原的抗體反應(yīng)隨著時(shí)間的推移而增加。同時(shí),，加強(qiáng)免疫后4種抗原的抗體水平顯著升高,。這些結(jié)果表明，mRNA -ALAB- LNP疫苗能夠誘導(dǎo)強(qiáng)效的抗原特異性結(jié)合抗體反應(yīng),。
圖4：mRNA-ALAB-LNP在小鼠體內(nèi)引起強(qiáng)效抗體反應(yīng)
mRNA-ALAB-LNP疫苗免疫血清展現(xiàn)了強(qiáng)效的痘病毒中和活性
為了確定mRNA -ALAB- LNP疫苗產(chǎn)生的抗體是否具youbing毒中和活性,，我們用100 CCID50 VACV病毒和增強(qiáng)疫苗注射后2周的滅活血清孵育，以檢測(cè)中和活性,。通過(guò)觀察和分級(jí)細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)來(lái)計(jì)算血清中和活性,。病毒對(duì)照(VC)和空載LNP免疫血清，在1:80的稀釋下,，未表現(xiàn)出中和活性,，感染的BSC-1細(xì)胞顯示出明顯的CPE(圖5A)。相反,，mRNA -ALAB- LNP接種小鼠的免疫血清,，在1：80和1：640和1：1280的稀釋下，在感染的BSC-1細(xì)胞中未見(jiàn)CPE,，顯示出細(xì)胞免受病毒感染的保護(hù)(圖5A),。在本實(shí)驗(yàn)中，mRNA -ALAB- LNP的平均中和抗體滴度可達(dá)1431 (圖5B),。
圖5：mRNA-ALAB-LNP誘導(dǎo)出抗牛痘病毒的強(qiáng)效中和抗體
mRNA-ALAB-LNP疫苗在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)抗原特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)
為了探討mRNA疫苗是否能誘導(dǎo)小鼠特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答,，在增強(qiáng)針注射45 d后收集小鼠脾細(xì)胞，分別用ELISPOT法檢測(cè)針對(duì)6種抗原肽文庫(kù)A27,、L1-1,、L1-2、A33,、B5-1,、B5-2的特異性IFN-γ陽(yáng)性T細(xì)胞。對(duì)所有四種抗原均檢測(cè)到特異性IFN-γ應(yīng)答,，且應(yīng)答顯著高于空白LNP免疫對(duì)照組(圖6A)。A27肽庫(kù)和A33肽庫(kù)對(duì)IFN-γ的刺激水平較高,，分別為904個(gè)點(diǎn)/百萬(wàn)細(xì)胞和27747個(gè)點(diǎn)/百萬(wàn)細(xì)胞,。與抗A33的總特異性IgG應(yīng)答zuigao一致(圖3D),，對(duì)A33肽庫(kù)的應(yīng)答中IFN-γ應(yīng)答也zuigao(圖6B)。
圖6：mRNA-ALAB-LNP誘導(dǎo)小鼠細(xì)胞免疫應(yīng)答(n=4)
mRNA-ALAB-LNP接種小鼠血清顯示針對(duì)猴痘病毒同源抗原的高水平交叉結(jié)合效應(yīng)
將mRNA-ALAB-LNP免疫小鼠的免疫血清依次稀釋,，與4種蛋白A29,、M1、220 A35和B6孵育,，檢測(cè)交叉結(jié)合抗體滴度,。ELISA結(jié)果顯示，shouci免疫后對(duì)猴痘抗原A35,、M1,、222、A29和B6均有較強(qiáng)的血清IgG應(yīng)答,，且隨著免疫時(shí)間的延長(zhǎng),，抗體滴度逐漸升高。(圖7A- 223 7D),?？笰29抗體平均滴度從2040 (初次免疫后2周)增加到4440 (初次免疫后4周)，抗M1抗體從74520 (初次免疫后2周)增加到184680 (初次免疫后4周),，抗A35抗體從2520 (初次免疫后2周)增加到9000 (初次免疫后4周),，抗B6特異性抗體從5880 (初次免疫后2周)增加到10920 (初次免疫后4周)。此外,，增強(qiáng)免疫2周后,，4種抗體水平均顯著升高，其中抗A29,、抗M1,、抗A35和抗B6抗體滴度分別達(dá)到110000、2430000,、558000和1782000,。總之,，這些結(jié)果表明,，編碼牛痘抗原(A27、L1,、232,、A33和B5)的mRNA-ALAB-LNP疫苗在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)了針對(duì)各自猴痘抗原(A29、M1,、A35和B6)的等效或更好的交叉反應(yīng)抗體,。(圖7 A-7D)。
圖7：mRNA-ALAB-LNP可誘導(dǎo)針對(duì)MPXV抗原的強(qiáng)效交叉反應(yīng)抗體,。
綜上所述,，本研究基于牛痘病毒抗原A27, L1, A33,、B5，開(kāi)發(fā)了一種新的四價(jià)mRNA-ALAB-LNP疫苗,，具有潛在的抗正痘病毒的潛力,。該候選疫苗對(duì)牛痘病毒和猴痘產(chǎn)生了顯著的抗體應(yīng)答。這些數(shù)據(jù)證明了mRNA-ALAB- 282 LNP疫苗設(shè)計(jì)的可行性,，并提供了其作為廣泛的正痘病毒候選疫苗的潛力的初步證據(jù),。
文獻(xiàn)來(lái)源：
Su et al., A Quadrivalent mRNA immunization elicits potent immune responses against vaccinia and monkeypox viral antigens – a step closer to a broad orthopoxvirus vaccine. bioRxiv. Doi: 10.1101/2023.04.23.537951.
