納米藥物制備系統(tǒng)

促進(jìn)CAR-T轉(zhuǎn)染的材料 —— 生物評價實(shí)驗(yàn)

時間：2022/5/11閱讀：423

一,、體外試驗(yàn)

1.轉(zhuǎn)染效率

轉(zhuǎn)染效率指被貨物成功轉(zhuǎn)換或改造的細(xì)胞比例,。高的轉(zhuǎn)染比例是非常重要的一個參數(shù),，尤其對于起始細(xì)胞數(shù)量比較低的情況,。分別編碼熒光或生物發(fā)光蛋白（如GFP和luciferase）的DNA可以克隆到CAR的轉(zhuǎn)基因用于鑒別被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞,。轉(zhuǎn)染效率可以通過計(jì)算成功表達(dá)熒光或生物發(fā)光蛋白的細(xì)胞比例來評估。另外,，可以通過優(yōu)化各種試驗(yàn)條件,，如DNA-試劑的比例、孵育時間等,。

GFP是常使用的報告系統(tǒng),，可以使用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀來觀察。流式細(xì)胞術(shù)相比熒光顯微鏡有更高的靈敏度和通量。在關(guān)于T細(xì)胞轉(zhuǎn)染的大部分文獻(xiàn)中,，轉(zhuǎn)染效率沒有考慮死細(xì)胞因而人為增加了轉(zhuǎn)染效率,。我們鼓勵采用更加客觀的方式，包括考慮死細(xì)胞,，因?yàn)榧?xì)胞活性也是評估轉(zhuǎn)染技術(shù)是否合適的重要考量,。另外，轉(zhuǎn)染后的時間也應(yīng)該明確,，因?yàn)樨浳锊粫€(wěn)定地整合入基因組,，轉(zhuǎn)染效率會隨著細(xì)胞分裂而降低。這對于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CAR-T細(xì)胞的應(yīng)用是一個有利的考量,。

2.貨物定位

一個典型的轉(zhuǎn)染過程涉及3-4個步驟：貨物包裝,，跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，細(xì)胞內(nèi)釋放,，轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞核,。貨物的位置很大程度上影響它們是否能夠履行其預(yù)期的功能。例如,，對于基因編輯,，貨物必須定位在細(xì)胞核。因?yàn)閷τ陂L期穩(wěn)定的基因表達(dá)和基因編輯,，貨物必須進(jìn)入細(xì)胞核，并整合入基因組中,，因此貨物的定位可視化將會非常有用,。另外，對于siRNA介導(dǎo)的基因沉默或蛋白瞬時表達(dá),，藥物必須被遞送進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中,。熒光共聚焦顯微鏡是最直接的和普遍使用的評估貨物定位的方法。貨物通常用熒光染料染色,，細(xì)胞核用DAPI染色,，從而可視化熒光信號的共定位?？梢酝ㄟ^一些方法改善貨物在細(xì)胞核的定位,，如使用細(xì)胞核定位信號和微管相關(guān)序列。

3.細(xì)胞增殖試驗(yàn)

細(xì)胞倍增時間是細(xì)胞治療的一個重要考量,。這是因?yàn)槌跗诳梢允褂玫募?xì)胞數(shù)量有限,，在危重病人或老年人中健康細(xì)胞的數(shù)量可能非常少。因此,，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞擴(kuò)增是非常重要的,，并且這個過程耗時耗力。因此，由于轉(zhuǎn)染導(dǎo)致的細(xì)胞倍增時間的增加是有害的,，可能也表明了細(xì)胞壓力,，衰老或耗竭。轉(zhuǎn)染技術(shù)不能明顯干擾細(xì)胞增殖,，因?yàn)檫@會繼而延長CAR-T的治療時間,，從而大幅增加治療成本。細(xì)胞數(shù)量可以通過顯微鏡計(jì)算存活率得到,，但是不能提供細(xì)胞分裂速率隨時間的變化,。CFSE是一種常用的確定T細(xì)胞增殖速率的熒光標(biāo)記。使用CFSE染料標(biāo)記細(xì)胞后,，每一代子細(xì)胞中的熒光信號逐漸減半,，通過流式細(xì)胞儀可以跟蹤T細(xì)胞的增殖。

4.細(xì)胞擾動

在轉(zhuǎn)染過程中,，T細(xì)胞可能會經(jīng)歷不同程度的擾動,，進(jìn)而影響它們的關(guān)鍵生理特性，如基因表達(dá),。評估細(xì)胞擾動有以下幾種方式,。鈣離子調(diào)節(jié)不同的細(xì)胞功能，作為第二信使參與多種細(xì)胞通路活動,。細(xì)胞質(zhì)中的鈣離子水平通常維持在100*10^-9M,，遠(yuǎn)低于在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體及細(xì)胞外環(huán)境的鈣離子水平（兩者分別在µM和mM范圍）。細(xì)胞內(nèi)熒光鈣水平的持續(xù)增加是細(xì)胞壓力的表現(xiàn),，可能會引起應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的信號通路,。在轉(zhuǎn)染過程中，貨物通過機(jī)械穿孔或電流滲透的方式被引入細(xì)胞,。這些過程在細(xì)胞膜上形成了孔道,，鈣離子將會順著濃度梯度進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的水平的增加和高水平的持續(xù)時間是膜孔恢復(fù)穩(wěn)態(tài)所需時間的指標(biāo),。一種定量評估鈣壓力的方法是使用熒光指示劑,，如Fura-2，Indo-1和Fluo-4,，并計(jì)算熒光扣除背景熒光之后的變化,。另一種觀測細(xì)胞內(nèi)鈣水平的方法是通過使用基因編碼的熒光蛋白，如基因編碼的鈣指示劑（GCaMP）,。相比化學(xué)指示劑,，基因編碼的熒光蛋白不會造成細(xì)胞毒性，更適合長期觀測,，但挑戰(zhàn)是質(zhì)粒構(gòu)造必須被優(yōu)化以確保蛋白可以穩(wěn)定表達(dá),。

5.T細(xì)胞激活和細(xì)胞因子試驗(yàn)

穩(wěn)健的T細(xì)胞激活是細(xì)胞快速擴(kuò)增的先決條件。T細(xì)胞早期激活標(biāo)志物CD69可用于確定是否該生物特性被轉(zhuǎn)染影響?；罨?，T細(xì)胞分泌一系列的效應(yīng)細(xì)胞因子，如IL-2,，TNF-α,，IFN-γ（可以通過ELISA試驗(yàn)檢測）。另一個更復(fù)雜的方法,，多參數(shù)細(xì)胞因子染色不僅可以用于測定細(xì)胞因子的產(chǎn)生,，還可以測定特定細(xì)胞亞型的功能標(biāo)記分子。但該實(shí)驗(yàn)方法的缺點(diǎn)是靈敏度低,，需要大量的實(shí)驗(yàn)方案優(yōu)化,。

6.T細(xì)胞特異性

抗原特異性的T細(xì)胞可以增強(qiáng)療效和確保安全性。MHC多聚體技術(shù)可以用于測量修飾后的CAR受體/T細(xì)胞受體（TCR）和遞呈在MHC分子表面的特定腫瘤抗原之間傳導(dǎo)的免疫信號,。這種單細(xì)胞試驗(yàn)使用多種MHC-I或MHC-II分子亞基（二聚體到八聚體）分別驗(yàn)證與表達(dá)CAR的CD8+或CD4+TCR之間的免疫作用,。常用的四聚體技術(shù)是將四個生物素化肽-MHC糖蛋白鏈與鏈酶親和素主鏈連接在一起。

在一眾免疫學(xué)評價技術(shù)中,，如ELISpot,，細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色，標(biāo)記物分泌試驗(yàn)等,，MHC四聚物染色可以改善抗原識別信號的特異性,。而且不像前述提到的功能性試驗(yàn)依賴抗原誘導(dǎo)的細(xì)胞因子或標(biāo)記物表達(dá)，它是一種直接的滴定方法,。不同的試劑如熒光探針,，DNA條形碼，重金屬標(biāo)記被用于錨定在多聚物上,，之后使用多種檢測技術(shù)如流式細(xì)胞儀,，測序,，質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù)等實(shí)現(xiàn)抗原特異性T細(xì)胞的識別,。但一個重要的限制是MHC四聚物對不同T細(xì)胞的敏感性不同。例如,，MHC-II與CD8+TCR細(xì)胞的結(jié)合力比MHC-I與CD4+TCR的親和力更強(qiáng),。而與T細(xì)胞結(jié)合的低親和力會折損評估免疫反應(yīng)的能力，降低標(biāo)記效率,。因此該技術(shù)需要調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)量實(shí)現(xiàn)T細(xì)胞反應(yīng)的穩(wěn)定檢測,。

7.T細(xì)胞遷移

實(shí)體瘤對于CAR-T療法仍然是一個巨大的挑戰(zhàn)，一個挑戰(zhàn)是CAR-T細(xì)胞的腫瘤浸潤性差,。T細(xì)胞能夠響應(yīng)生物分子遷移,，而T細(xì)胞的遷移是一個非常重要的考量，因?yàn)門細(xì)胞對化學(xué)引誘劑的敏感性和遷移能力影響它們的效力，尤其是對實(shí)體瘤的效力,。如果T細(xì)胞可以在實(shí)體瘤里遷移更快更均一,，將可能實(shí)現(xiàn)更好的臨床效果。Transwell試驗(yàn)是評價細(xì)胞遷移的常用方法,，該方法使用一個填充了兩種介質(zhì)的小室,，一種介質(zhì)是趨化因子如IP-10，另一種是結(jié)合了CXCR3受體的化學(xué)引誘劑,，通過多種膜分開兩種介質(zhì),。T細(xì)胞培養(yǎng)在小室上層，一旦感知到趨化因子的化學(xué)梯度,，將會遷移到小室下層,。培養(yǎng)一段時間后，上層小室被移開,，遷移到膜上的細(xì)胞數(shù)量可以在顯微鏡下通過血球計(jì)數(shù)確定,。膜孔的大小需要謹(jǐn)慎選擇，避免細(xì)胞的非特異性轉(zhuǎn)移,。如果使用了熒光標(biāo)記的T細(xì)胞,，可以通過熒光顯微鏡觀察隨時間變化的遷移行為。

8.T細(xì)胞毒性試驗(yàn)

T細(xì)胞通過分泌細(xì)胞毒性顆粒移除腫瘤,。因此評估轉(zhuǎn)染后CD8+ CAR-T細(xì)胞的細(xì)胞毒功能是非常重要的,。該實(shí)驗(yàn)可以通過混合細(xì)胞膜染料（如PKH-26或紅色熒光蛋白）標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞和表達(dá)生物熒光或熒光蛋白的CAR-T細(xì)胞，共孵育一段時間后,，通過流式細(xì)胞術(shù)評估細(xì)胞的體外殺傷能力,，腫瘤細(xì)胞計(jì)數(shù)，和CAR-T細(xì)胞繁殖能力,。CAR-T細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的微流控共培養(yǎng)可以用于該實(shí)驗(yàn),。

二、體內(nèi)試驗(yàn)

1. T細(xì)胞增殖

雖然大量的CAR-T細(xì)胞被輸入病人體內(nèi),，但并不是所有都可以存活,。實(shí)現(xiàn)持續(xù)性的抗腫瘤作用，需要CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)持續(xù)增殖,，提供長期保護(hù),。然而，腫瘤微環(huán)境可能會抑制T細(xì)胞的增殖,，探明CAR-T細(xì)胞能否在腫瘤內(nèi)繼續(xù)增值,，發(fā)揮有效的抗腫瘤效應(yīng)，是非常重要的,。具有熒光標(biāo)記的轉(zhuǎn)染T細(xì)胞可以抽取外周血并計(jì)數(shù)得到,。對于腫瘤浸潤的T細(xì)胞,，可以通過腫瘤切片、消化,，并通過流式細(xì)胞術(shù)確定數(shù)量,。

2. T細(xì)胞招募和腫瘤浸潤

CAR-T細(xì)胞必須浸潤實(shí)體瘤，并釋放細(xì)胞毒性顆?；蛐?yīng)細(xì)胞因子才能發(fā)揮作用,。腫瘤浸潤細(xì)胞的數(shù)量多和空間分布均一是一個良好的預(yù)后生物標(biāo)記。將腫瘤組織切片,，在膠原酶中消化,，通過過濾腫瘤懸浮液可以得到單分散的腫瘤浸潤T細(xì)胞。被過濾的細(xì)胞通過熒光抗體如抗-CD4抗體,、抗-CD8抗體,，進(jìn)行染色，使用流式細(xì)胞術(shù)可以檢測CD4+輔助T細(xì)胞和CD8+細(xì)胞毒T細(xì)胞的比例,。進(jìn)一步檢測T細(xì)胞在腫瘤中的分布,，可以將腫瘤組織切薄片，并用熒光抗體進(jìn)行染色,，使用共聚焦成像觀測腫瘤浸潤細(xì)胞在腫瘤組織和細(xì)胞外間質(zhì)中的分布,。然而，顯微鏡的穿透力限制可能意味著更深區(qū)域的浸潤細(xì)胞難以檢測,。Boissonnas等提議使用雙光子活體鏡檢和免疫熒光可以檢測腫瘤外周和深層區(qū)域的T細(xì)胞,。空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)等新興技術(shù)也可以幫助提供腫瘤組織中新的免疫細(xì)胞和癌細(xì)胞類型的空間圖,。

3. 腫瘤抑制試驗(yàn)

成功的CAR-T療法必須抑制腫瘤成長,，增加存活率。使用注射了腫瘤細(xì)胞或病人來源的移植瘤動物模型可以評估CAR-T細(xì)胞的體內(nèi)腫瘤抑制效果,。腫瘤大小可以通過非侵入性的CAR-T體內(nèi)成像,，或熒光/生物發(fā)光標(biāo)記的癌細(xì)胞來確定。在動物被處死之前,，通常會觀察腫瘤生長的進(jìn)展,。之后，腫瘤從動物體內(nèi)移出,，稱重,，用卡尺測量大小,。腫瘤組織也可以通過TUNEL染色,，激光共聚焦顯微鏡觀測凋亡癌細(xì)胞的數(shù)量。

4. CAR-T療法的安全性試驗(yàn)

雖然CAR-T療法是治療癌癥的很有前景的療法,，但它可能會造成嚴(yán)重的副作用和毒性,。由于CAR蛋白在健康細(xì)胞中的低表達(dá)水平,，臨床和臨床前試驗(yàn)中報道的導(dǎo)致健康組織損傷的靶向/非腫瘤毒性是主要的副作用。安全性評價可以通過兩種方式評估,。一種是測定血液中細(xì)胞因子的水平,。主要的細(xì)胞因子是IL-6，它與細(xì)胞因子釋放綜合征和神經(jīng)毒性有關(guān),。第二種是檢測CAR-T細(xì)胞在健康組織中的浸潤,。動物處死后，獲取腎臟和肝臟,，這些組織使用蘇木精/伊紅染色,，其他的抗體用于檢測CAR-T的浸潤和器官損傷。

轉(zhuǎn)染后CAR-T細(xì)胞的生物學(xué)評估試驗(yàn)

三,、展望

過去20年,，各種各樣的轉(zhuǎn)染技術(shù)被開發(fā)。病毒載體和大面積電穿孔被用于產(chǎn)生FDA批準(zhǔn)的CAR-T產(chǎn)品,。微納米技術(shù)的進(jìn)展也期待可以加速轉(zhuǎn)染方法的發(fā)展,。為了增強(qiáng)在臨床轉(zhuǎn)化的作用，需要細(xì)胞內(nèi)遞送的技術(shù)克服這些挑戰(zhàn),。

首先,，載體必須可以運(yùn)送更大和更復(fù)雜的貨物，甚至可以在不同的環(huán)境下,，高特異性地同時遞送多種貨物,。

其次，隨著CAR-T療法地流行,，高通量細(xì)胞轉(zhuǎn)染地需求將不可避免地增加,，尤其是對于自體CAR-T產(chǎn)品。

第三,，隨著特定腫瘤和免疫細(xì)胞類型及它們在腫瘤免疫治療中的相互作用的相關(guān)單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)的增加,，優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件對于提高通量和降低成本是必須的。

最后,，隨著CAR-T產(chǎn)品需求增加的預(yù)期,，重要的是可以實(shí)現(xiàn)按GMP認(rèn)證的方式進(jìn)行轉(zhuǎn)染技術(shù)的放大。

促進(jìn)CAR-T轉(zhuǎn)染的材料 —— 生物評價實(shí)驗(yàn)

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