圖一、高通量LNP篩選技術(shù)促進(jìn)肺靶向新型陽離子脂質(zhì)的開發(fā)流程示意圖

材料與方法

1.1 脂質(zhì)合成與初步篩選：

研究團(tuán)隊(duì)組合合成了180種陽離子,、可降解的脂質(zhì)（CAD脂質(zhì)）,，這些脂質(zhì)具有不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

使用體外高通量篩選方法,，初步評估這些CAD LNP遞送mRNA的潛力,。

1.2 Barcode技術(shù)應(yīng)用：

從初步篩選中選出96種有潛力的CAD LNP，用于封裝Barcode DNA和螢火蟲熒光素酶（FLuc）mRNA,。

將這些LNP配方合并，通過系統(tǒng)性給藥方式注入小鼠體內(nèi),。

利用深度測序技術(shù),，量化不同器官（心臟、肝臟,、脾臟,、肺和腎臟）中Barcode DNA的遞送和積累情況。

1.3 候選LNP的進(jìn)一步評估：

根據(jù)深度測序結(jié)果,，選出前4種在肺部具有最高遞送效率的LNP進(jìn)行進(jìn)一步評估,。

通過在小鼠體內(nèi)遞送FLuc mRNA，評估這些LNP在肺部的mRNA遞送效率,。

1.4 抗血管生成治療潛力評估：

選定最佳LNP配方（LNP-CAD9）,，用于遞送CRISPR-Cas9系統(tǒng)和靶向VEGFR2的sgRNA至小鼠肺部。

評估LNP-CAD9在肺腫瘤模型中誘導(dǎo)VEGFR2基因敲除和抑制腫瘤生長的能力,。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 高通量篩選：

為了高效地篩選出具有肺部靶向能力的陽離子可降解脂質(zhì)類似物,，研究者們設(shè)計(jì)了一個(gè)基于Barcode DNA的高通量LNP篩選系統(tǒng)。這一系統(tǒng)使得在同一個(gè)動物體內(nèi)能夠同時(shí)評估多種納米顆粒,，從而極大地提高了篩選效率,。

研究者們首先合成了180種陽離子可降解脂質(zhì)（CAD脂質(zhì)），并通過體外高通量篩選初步評估了它們的遞送潛力,。在這一階段,，他們利用螢火蟲熒光素酶（FLuc）編碼的mRNA來研究CAD LNPs的遞送能力。

隨后,，從初步篩選出的CAD LNPs中選擇了96種,，用于封裝Barcode DNA和FLuc mRNA。將這些LNP制劑混合后,，通過系統(tǒng)給藥的方式注入小鼠體內(nèi),。利用深度測序技術(shù)，研究者們能夠量化這些LNPs在各個(gè)器官（心臟,、肝臟,、脾臟,、肺部和腎臟）中的積累情況，從而識別出具有肺部靶向能力的CAD脂質(zhì)候選物,。通過體內(nèi)篩選,，發(fā)現(xiàn)了21種在體內(nèi)具有肺部遞送能力的CAD LNP，并進(jìn)一步通過富集分析確定了LNP配方（LNP-CAD3,、LNP-CAD4,、LNP-CAD9和LNP-CAD10），這些配方能夠高效地將核酸貨物遞送到肺部,。

為了驗(yàn)證Barcode DNA積累量能否準(zhǔn)確反映CAD LNPs的mRNA遞送能力,，研究者們選擇了在肝臟中表現(xiàn)最佳的LNP-CAD20進(jìn)行體內(nèi)FLuc mRNA遞送實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明,，該LNP能夠在肝臟中特異性地表達(dá)熒光素酶,，這支持了高通量Barcode篩選結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.2 構(gòu)效關(guān)系研究結(jié)果：

化學(xué)結(jié)構(gòu)與遞送效率的關(guān)系：

研究了CAD脂質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)對其遞送效率的影響,。通過改變脂質(zhì)的化學(xué)特性（如離子化性質(zhì),、尾部結(jié)構(gòu)等），發(fā)現(xiàn)這些變化對LNP的遞送效率有顯著影響,。特定的化學(xué)結(jié)構(gòu)特征（如特定的離子化脂質(zhì)尾部結(jié)構(gòu)）被發(fā)現(xiàn)能夠增強(qiáng)LNP對肺部的靶向性,。

LNP的物理特性與遞送效率的關(guān)系：

研究了LNP的物理特性（如粒徑、表面電荷等）對其遞送效率的影響,。通過調(diào)整這些物理特性,，發(fā)現(xiàn)能夠進(jìn)一步優(yōu)化LNP的遞送效率。例如,，具有均勻固體核心形態(tài)的CAD LNP在遞送mRNA時(shí)表現(xiàn)出更高的效率,。

圖二、不同結(jié)構(gòu)CAD脂質(zhì)與體外細(xì)胞表達(dá)的構(gòu)效關(guān)系研究

圖三,、Barcode標(biāo)記的96種不同陽離子LNP與體內(nèi)器官靶向分布的構(gòu)效關(guān)系研究

2.3 最佳LNP配方的確定：

體內(nèi)遞送效率：為了驗(yàn)證這4種LNP配方的mRNA肺部遞送效率,，研究人員將含有螢火蟲熒光素酶（FLuc）mRNA的LNP-CAD3、LNP-CAD4,、LNP-CAD9和LNP-CAD10以0.1mg/kg的劑量系統(tǒng)注射到C57BL/6J雌性小鼠體內(nèi),。通過生物發(fā)光成像技術(shù)確認(rèn)，這4種CAD LNPs均能夠按預(yù)期將mRNA遞送到肺部,。

與金標(biāo)準(zhǔn)系統(tǒng)的比較：為了評估LNP-CAD9的遞送潛能,，研究人員還制備了一種金標(biāo)準(zhǔn)肺靶向MC3/DOTAP LNP系統(tǒng)，該系統(tǒng)已被FDA批準(zhǔn)用于MC3LNP中的mRNA肺部遞送,。比較結(jié)果顯示,，LNP-CAD9在肺部遞送效率方面顯著優(yōu)于MC3/DOTAP系統(tǒng)

圖四、小鼠肺靶向LNP的優(yōu)選分子的評價(jià)與驗(yàn)證

2.4 抗血管生成治療潛力：

除了評估CAD LNPs的遞送效率外,，研究者們還探索了它們在抗血管生成癌癥治療中的潛在應(yīng)用,。LNP-CAD9遞送Cas9 mRNA和靶向VEGFR2的sgRNA,，在4.0 mg/kg的劑量下有效誘導(dǎo)小鼠肺內(nèi)皮細(xì)胞的VEGFR2基因敲除。在肺腫瘤模型中,，LNP-CAD9表現(xiàn)出顯著的抗血管生成治療潛力,，能夠抑制腫瘤生長，其療效優(yōu)于金標(biāo)準(zhǔn)的肺趨向性MC3/DOTAP LNP系統(tǒng),。

圖五：CAD9 LNP敲除VEGFR2產(chǎn)生抗血管生產(chǎn)作用治療小鼠肺腫瘤的效果評價(jià)

討論

本研究通過高通量篩選技術(shù),，成功鑒定了具有肺部靶向性的陽離子、可降解類脂質(zhì)材料,。LNP-CAD9作為其中的杰出者,，在抗血管生成癌癥治療中展現(xiàn)出了巨大潛力。高通量篩選技術(shù)的運(yùn)用,，不僅加速了LNP的發(fā)現(xiàn)過程,，還克服了基因治療應(yīng)用中肺部遞送的障礙。

高通量篩選技術(shù)在本研究中的作用主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：

1.提高了篩選效率：通過自動化設(shè)備和先進(jìn)的檢測方法,，高通量篩選技術(shù)能夠在短時(shí)間內(nèi)對大量化合物進(jìn)行快速篩選，從而極大地提高了新藥發(fā)現(xiàn)的效率,。在本研究中,，我們成功篩選了180種化學(xué)性質(zhì)不同的CAD LNP，并確定了多種高效遞送LNP,。

2.增強(qiáng)了篩選準(zhǔn)確性：高通量篩選技術(shù)具有高度的靈敏度和特異性,，能夠準(zhǔn)確識別出具有潛在生物活性的化合物。在本研究中,，我們利用Barcode技術(shù),，實(shí)現(xiàn)了對LNP體內(nèi)遞送效率的精確量化，從而確保了篩選結(jié)果的準(zhǔn)確性,。

3.拓展了應(yīng)用范圍：高通量篩選技術(shù)不僅適用于藥物研發(fā)領(lǐng)域,，還可應(yīng)用于生物學(xué)研究、器官篩查,、基因工程等多個(gè)方面,。在本研究中，我們成功將高通量篩選技術(shù)應(yīng)用于LNP的篩選和優(yōu)化,，為基因治療領(lǐng)域的發(fā)展提供了新的思路和方法,。

參考文獻(xiàn)：Xue, Lulu, et al. "High-throughput barcoding of nanoparticles identifies cationic, degradable lipid-like materials for mRNA delivery to the lungs in female preclinical models." Nature Communications 15.1 (2024): 1884.