Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒 

包裝規(guī)格 

產(chǎn)品貨號(hào)：An0020,、An0050,、An0100 

規(guī)格：20T、50T,、100T 

儲(chǔ)存條件 

4oC保存,，一年有效

產(chǎn)品介紹： 

磷脂酰絲氨酸（PS）是一種帶負(fù)電荷的磷脂，正常細(xì)胞中,，PS只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè),，而在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞膜 PS由脂膜內(nèi)側(cè)翻向細(xì)胞膜外側(cè),，使PS暴露在細(xì)胞膜外表面,。Annexin V是一種分子量為35~36kD的Ca2+ 依賴(lài)性磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力,，故可通過(guò)細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié) 合,。因此Annexin V被*為檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之一。 

Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒將Annexin V進(jìn)行綠色熒光（FITC）標(biāo)記,，以標(biāo)記了的Annexin V作為探針,，利用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀 可檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一種核酸染料,，它不能透過(guò)正常細(xì)胞或早期凋亡細(xì)胞的完 整的細(xì)胞膜,，但對(duì)凋亡中晚期的細(xì)胞和壞死細(xì)胞，PI能夠透過(guò)細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染紅,。因此采用Annexin V與PI雙染的方法,，就可以將處于不同凋亡時(shí)期的細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)。

圖 1. 細(xì)胞凋亡過(guò)程中磷脂酰絲氨酸（PS）外翻示意圖

試劑盒組份：

所需實(shí)驗(yàn)器材： 

微量移液器,；PBS,；不含 EDTA 的胰酶消化液；低速離心機(jī),；流式細(xì)胞儀 

注意事項(xiàng)： 

1. 此試劑盒僅供研究使用,。 

2. 微量試劑需離心數(shù)秒將試劑收集至管底后再開(kāi)蓋取用。 

3. Propidium Iodide（PI）有毒,，操作時(shí)要帶手套,，使用時(shí)避免與皮膚，眼睛和黏膜接觸,。

4. Annexin V-FITC 中含有毒成分三氮化鈉（NaN3）, 操作時(shí)要帶手套,，使用時(shí)避免與皮膚,，眼睛和黏膜接觸。 

5. 本試劑盒用于檢測(cè)活細(xì)胞,，流式細(xì)胞儀檢測(cè)時(shí),，細(xì)胞數(shù)量不應(yīng)低于 1x106。 

6. 染色后宜盡快檢測(cè),，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能會(huì)導(dǎo)致凋亡或壞死細(xì)胞的數(shù)量增加,。 

7. Annixin V 檢測(cè)凋亡細(xì)胞的方法適用于懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞，如：淋巴細(xì)胞等細(xì)胞的檢測(cè),。對(duì)于貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞,，由于 在胰酶等消化處理過(guò)程中會(huì)造成細(xì)胞膜的損傷，會(huì)造成較高的假陽(yáng)性,，而用細(xì)胞刮子會(huì)造成細(xì)胞粘連成團(tuán),，而影響 檢測(cè)，可將胰酶消化后的細(xì)胞保存在含 2%BSA 的 PBS 中,，防止進(jìn)一步的損傷,。盡管目前，包括國(guó)外也有一些單 位采用該方法檢測(cè)貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞,。我不推薦用該方法檢測(cè),。因?yàn)槠渲貜?fù)性較差，且需要操作時(shí)非常小心,。 

8. 消化貼壁細(xì)胞殘留的胰酶會(huì)消化并降解 Annexin V-FITC,，最終導(dǎo)致染色失敗。 

9. 細(xì)胞固定后可能導(dǎo)致熒光的淬滅,，請(qǐng)不要固定樣品,。

操作說(shuō)明： 

1. 細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備： 

a) 懸浮細(xì)胞： 

1）收集細(xì)胞至離心管中 1000-2000rpm 離心 5min，小心去除上清,。 

2）用 1ml 4℃預(yù)冷 PBS 輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù),，1000-2000rpm 離心 5min，小心吸除上清,。 

3）再加入 1ml 4℃預(yù)冷的 PBS 重懸細(xì)胞,，1000-2000rpm 離心 5min，小心吸除上清,。 

b) 貼壁細(xì)胞： 

1）吸出細(xì)胞培養(yǎng)液至離心管中,，PBS 洗滌貼壁細(xì)胞一次，加入適量不含 EDTA 的胰酶細(xì)胞消化液消化細(xì)胞,。 

2）室溫孵育至輕輕吹打可以使貼壁細(xì)胞吹打下來(lái)時(shí),，吸除胰酶細(xì)胞消化液。需避免胰酶的過(guò)度消化。 

3）加入以上步驟中收集的細(xì)胞培養(yǎng)液,，稍混勻,，轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，1000-2000rpm 離心 5min,，小心吸除上清,。 注：加入的細(xì)胞培養(yǎng)液一方面可以收集已經(jīng)懸浮的發(fā)生凋亡或壞死的細(xì)胞，另一方面細(xì)胞培養(yǎng)液中的血清可 以有效抑制或中和殘留的胰酶,；殘留的胰酶會(huì)消化并降解后續(xù)加入的 Annexin V-FITC 導(dǎo)致染色失敗,。 

4）用 1ml 4℃預(yù)冷 PBS 輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)，1000-2000rpm 離心 5min,，小心吸除上清。 

5）再加入 1ml 4℃預(yù)冷的 PBS 重懸細(xì)胞,，1000-2000rpm 離心 5min,，小心吸除上清。 

2. 用去離子水按 1：4 稀釋 Binding Buffer（4ml Binding Buffer+12ml 去離子水）,； 

3. 用 250?l 結(jié)合緩沖液重新懸浮細(xì)胞,，調(diào)節(jié)其濃度為 1×106/ml； 

4. 取 100?l 的細(xì)胞懸液于 5 ml 流式管中,，加入 5?l Annexin V-FITC,，輕輕混勻； 

5. 室溫(20-25oC)避光孵育 10min,； 

6. 上機(jī)前 5min 加入 10?l 碘化丙啶溶液,，輕輕混勻； 

7. 上機(jī)前在反應(yīng)管中補(bǔ)加 400?l PBS 重懸細(xì)胞,， 避光保存,，隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀（FACS）檢測(cè)， Annexin V-FITC 為綠色熒光,，PI 為紅色熒光,。

圖 2. 流式細(xì)胞儀檢測(cè)早期凋亡細(xì)胞。在雙變量流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上,，左下象限顯示活細(xì)胞,，右下象限為早期凋亡細(xì)胞，右上象限是凋亡晚期細(xì)胞和壞死細(xì)胞