簡介：

首先,，如果你已經(jīng)設(shè)計了引物，PCR擴增沒有條帶,，請這樣做：

使用第一次的PCR產(chǎn)物作為模版（1~2ul即可）,，再進行一次PCR。

那你要重新學(xué)習(xí)PCR擴增了,！這篇內(nèi)容,，涵蓋了實驗中可能遇到的PCR擴增問題和詳細的解決辦法，主要是如何培養(yǎng)問題解決問題的思考能力,，你必須要知道,！

PCR擴增主要包括以下幾個組分：1）引物；2）酶,；3）dNTP;4)Buffer;5)CDNA或DNA,。注：現(xiàn)今大部分PCR酶試劑盒一般都是酶，dNTP和Buffer的預(yù)混液,。

因此,，需要從引物，酶,，cDNA和DNA模版下手,，進行分析。

一共有以下三步：

第一步，一定要確定的是-cDNA,。

每個基因在不同組織,，不同時期中表達量是不同的。首先要確定你的基因在哪個組織,，哪個時期表達最高,，確認之后就選這些組織和時期，否則很難做出來,。

問題：怎么查找目的基因在哪個組織和時期中表達高,？

答：1）數(shù)據(jù)庫。例如NCBI數(shù)據(jù)庫,。

2）文章,。查詢你目的基因的別人做過的文章，看看他們使用的什么,。

3）新的基因,，沒有數(shù)據(jù)庫記載，沒有報道,，什么都不知道,。使用幾種組織的混合的cDNA.

第二步：檢查你的酶

酶的品質(zhì)（主要是公司的工藝好不好），活性,，保質(zhì)期,，buffer的凍融程度都會很大程度影響PCR擴增。因此,，換一個酶是相對簡單,，必須試用的方法。

第三步：最需要實驗經(jīng)驗-引物設(shè)計

解決了酶和cDNA的問題之后,，需要進行最復(fù)雜的引物設(shè)計,。引物設(shè)計是靈活的，根據(jù)目的的不同而不同,。qPCR引物設(shè)計因為可以在序列上隨機選擇,因此可以使用引物設(shè)計引物進行設(shè)計,，在這里我們主要詳解基因克隆的引物設(shè)計，一般包括CDS的設(shè)計,，基因區(qū)的設(shè)計，非編碼區(qū)的設(shè)計等,，這些片段的引物設(shè)計一般都固定在一段序列上,，不能隨意更改（GC含量，TM值都只能固定在一個相對范圍內(nèi)）,，因此需要一定的實驗經(jīng)驗和理論基礎(chǔ),，以下為詳細的解決方法。

1.GC含量低于40%或高于60%,長度不在18-25范圍內(nèi)，會出現(xiàn)引物二聚體,，設(shè)計的引物不能遵循引物設(shè)計的原則怎么辦,？

答：不是所有的引物都必須遵循引物設(shè)計的原則，也不是所有遵循引物設(shè)計設(shè)計原則的都可以擴增出來,。例如：GC含量為65%,，長度為28，如果實在設(shè)計不了符合原則的,，可以以相對符合的設(shè)計方式進行,，不必全部符合。

2.設(shè)計了好幾組引物,，都不能擴增出來,，怎么辦？

酶和cDNA都確定好之后,，引物仍然擴不出來條帶,，對于不同的目的可以使用不同的方法。

①對于鑒定目的基因,，只是想要確定這個基因的序列,，可以這樣做：

在引物兩端加一段堿基（5‘的序列可以自己設(shè)計），改變引物的GC含量,，TM值等,。

②對于僅需要擴增目的基因，不能在5’端添加堿基的情況,，且使用F2/R2不能擴增出條帶,，可以這樣做：

先在CDS兩端設(shè)計一對引物，先使用F1/R1進行擴增,。然后再使用CDS引物F2/R2進行擴增,。

③對于表達載體，需要擴增到載體上,，可以這樣做：

1）先設(shè)計CDS區(qū)的引物F2/R2擴增,，再使用這個PCR產(chǎn)物作為模版，使用帶酶切位點（藍色為酶切位點及保護堿基序列）的引物F1/R1進行擴增,。

2）改變所用的酶切位點,。

3）換連接方法。如果使用T4連接,，可以換成同源重組的方法,。

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